本发明专利技术公开了一种用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片及其检测方法。提供了探针和PCR引物，通过标准毒株基因组序列分析设计PCR引物，对目的基因克隆及测序分析，然后设计特异性探针，可对猪传染性胃肠炎病毒进行鉴定。本发明专利技术旨在建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的检测猪传染性胃肠炎病毒的芯片方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物芯片领域。具体而言，本专利技术涉及一种猪传染性胃肠炎病毒的芯 片检测装置。
技术介绍
猪传染性胃肠炎（porcine transmissible gastroenteritis, TGE)是由猪传染 性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)引起的以猪呕吐、 腹泻、脱水为特征的高度接触性传染病，对养猪业造成巨大的损失。该病可感染不同年龄的 猪，但对新生仔猪的致死率高达100%，成年猪感染后发病温和，可能会出现生长障碍和无乳 等现象。近年来，该病在世界各地频频发生，我国四川、湖北、吉林、陕西、台湾、北京、广州等 多个地区也均有流行，并且呈上升趋势。由于TGEV经常与其他病毒混合感染，或常伴细菌 的继发感染，使临床症状复杂多样，混合感染和继发感染大大增加了 TGEV诊断的难度。 猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV) 属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属的不分节段的单股正链RNA病毒。TGEV基因组 由7个开放阅读框（0RF1-0RF7)组成，5'端有甲基化的帽子结构，3'端有PloyA尾，使得 病毒RNA具有感染性。TGEV不仅能引起急性肠炎，而且常为持续感染，即在感染100d后，在 康复猪的呼吸道中仍能检测到病毒的存在，严重影响了养猪业的持续健康发展。猪对TGEV 最为易感，而猪以外的动物猫、狗、狐狸等不致病，但可带毒、排毒。大量的带毒动物促进了 猪传染性胃肠炎的爆发。因此，建立一种快速、准确检测该病毒的方法，有利于保障我国养 猪业的发展。在对其它动物或者肉制品的出入境快速检测中也有重要作用。 基因芯片（Gene chip)是由DNA或寡核苷酸探针密集排列在经过共价结合醛基、 氨基或多聚赖氨酸的固相支持物所形成的探针阵列，在适当的温度、湿度条件下，利用特异 性探针与经过适当方式标记的待检样品DNA通过碱基互补配对杂交，然后通过相应的检测 设备，检测杂交信号的位置和强弱，判断样品种类，完成疾病检测和基础研究等方面的工 作。该方法具有高通量、平行化、微量化、自动化、低成本的优点。因此，该技术被广泛应用 于诊断检测、差异表达分析、测序等诸多领域。目前，基因芯片检测技术已应用于多种疾病 的检测，但缺乏猪传染性胃肠炎病毒基因芯片的检测方法。综合寡聚核苷酸芯片的优点，本 专利技术建立一种快速、准确鉴定猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片检测技术，为控制猪传染性 胃肠炎病毒的传播及进出境动物的检疫具有重要作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的检 测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片。 为了实现上述目的本专利技术采用如下技术方案：用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基 因芯片，包括：PCR反应混合液、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH 20、检测芯片、 芯片探针的点样分布、芯片盖片、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒，采用基因芯片微量点样技 术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成的微阵列，其特征 在于：所述微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分 区： 点样位置质控分区（P1)，包含至少一个点样位置质控探针：SEQ ID NO. 2; 杂交阳性质控分区（P2)，包含至少一个杂交阳性质控探针：SEQ ID NO. 3; 杂交阴性质控分区（N)，包含点样缓冲液； 所述待测样品探针区内设置至少一个猪传染性胃肠炎病毒探针分区，其中猪传染性胃 肠炎病毒探针DNA序列为SEQ ID NO. 1。 利用上述基因芯片检测猪传染性胃肠炎病毒的检测方法，包括如下步骤： (1) 待测样品制备：按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或病 毒的细胞增殖液的全基因组RNA，进彳丁反转录，制备待测样品cDNA ; (2) PCR扩增：25 yLPCR反应液包含rTaq酶12.5 yL、引物Mix: 2.4yL、待测样品 DNA 5 y L、无核酸酶灭菌水5. 1 y L ; 其中，所引物Mix含有： 序列为3￡0 10勵.4的10 11111〇1/1猪传染性胃肠炎病毒上游引物0.2 1^， 序列为SEQ ID N0. 5的10 ymol/L猪传染性胃肠炎病毒下游引物0. 2 y L， 序列为SEQ ID NO. 6的20ymol/L通用引物上游引物lyL， 序列为SEQ ID NO. 7的20ymol/L通用引物下游引物lyL. 按如下步骤进行扩增：94°C 5 min;94°C 30 sec，56°C 30 sec，72°C 25 sec 循环 12 次；94°C 30 sec，5(TC 30 sec，72°C 25 sec 循环 30 次；72°C 5min; (3) 杂交：首先配制杂交缓冲液：杂交缓冲液7. 9 y L、PCR扩增产物8 y L、杂交阳性对 照0. 1 y L，混匀后95°C变性8min，冰上放置5min，然后取15 y L杂交液进行杂交； (4) 结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对 照，判定结果。 本专利技术具有如下优点： (1)成功地构建了 TGEV检测基因芯片：本专利技术所制备的基因芯片采用的各条筛选探针 可与对应病原体目的基因进行特异性结合，杂交信号较强且稳定。 (2)制备的检测基因芯片具有良好的方法学特征。本专利技术建立了一种特异性好、灵 敏度高、稳定性强和节时省力的基因芯片检测方法。 (3)检测基因芯片的构建，为混合感染疾病的同步检测和鉴别诊断提供快速、高效 的手段，为今后出入境动物检疫、出入境食品安全和相应疫病控制提供了技术保障。对满足 进出境动物检疫工作的需要，控制猪传染性胃肠炎病毒的传播，保障我国的畜牧业安全、健 康发展具有十分重要的意义。【附图说明】 图1为芯片探针分布不意图； 图2为猪传染性胃肠炎病毒核酸杂交结果； 图中：P1-点样位置质控分区；P2-杂交阳性质控分区；N-杂交阴性质控分区；1-猪传 染性胸膜肺炎放线杆菌探针分区；2-副猪嗜血杆菌探针分区；3-猪肺炎支原体探针分区； 4-猪圆环病毒2型探针分区；5-猪繁殖与呼吸综合征病毒探针分区；6-猪瘟病毒探针分 区；7-猪传染性胃肠炎病毒探针分区； 杂交说明：P1 :探针固定阳性对照，监控芯片点样过程，芯片杂交前后都应阳性； P2 :杂交阳性对照，监控芯片杂交过程，检测任何样品都应阳性； N :杂交阴性对照，检测任何样品都应阴性； 猪传染性胃肠炎病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，7号 探针壳。【具体实施方式】 下面提供具体实施例进一步阐述本专利技术的技术方案，但本专利技术技术的应用不限于 实施例。 实施例1，本专利技术是分别对猪传染性胃肠炎病毒细胞增殖，提取病毒基因组RNA， 并进行反转录。对猪传染性胃肠炎病毒的特异保守序列进行克隆、测序分析，根据测序结果 设计了 1条寡核苷酸探针，可与相应病原体的PCR产物进行特异性结合，PCR进行基因组扩 增时，上游通用引物5 '端利用Cy3荧光色素进行标记，探针可与此产物在4本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测猪传染性胃肠炎病毒的基因芯片，包括：PCR反应混合液、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH2O、检测芯片、芯片探针的点样分布、芯片盖片、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成的微阵列，其特征在于：所述微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区：点样位置质控分区（P1），包含至少一个点样位置质控探针:SEQ ID NO.2；杂交阳性质控分区（P2），包含至少一个杂交阳性质控探针:SEQ ID NO.3；杂交阴性质控分区（N），包含点样缓冲液；所述待测样品探针区内设置至少一个猪传染性胃肠炎病毒探针分区，其中猪传染性胃肠炎病毒探针DNA序列为SEQ ID NO.1。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王昱，杨俊，聂福平，李应国，保雨，李贤良，王国民，张超，艾军，
申请(专利权)人：重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：重庆;85
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。