牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan‑MGB实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒及检测方法。本方法设计获得了2条引物和一条特异的MGB探针，DNA序列分别为SEQ ID NO.1~3。该试剂盒包括扩增反应液、阳性对照、阴性对照和灭菌去离子水。本发明专利技术只需要两步扩增法即可以快速、高效、特异、敏感地检测目的靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，对操作人员没有技术上的要求，检测成本低，通量高，检测周期短。

【技术实现步骤摘要】
牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及动物病毒分子生物学检测方法领域。具体涉及一种牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
牛结节性皮肤病（Lumpyskindisease,LSD）又称牛疙瘩皮肤病、牛结节疹或牛结节性皮炎，是由牛结节性皮肤病病毒（Lumpyskindiseasevirus,LSDV）引起的一种牛的急性、亚急性传染病，各种牛均易感，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须通报的动物传染病，是《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》规定的一类传染病。该病的感染率为5%~85%，病死率为10%；其主要临床特征为病牛皮肤表面出现大量疙瘩样结节，体温升高至40℃以上，消瘦，产奶量剧减约50%。同时，还可致原发性和继发性肺炎，感染的患畜四肢因滑膜炎和腱鞘炎而引起跛行，患病母畜流产，公畜暂时或永久不育，严重时导致死亡；皮张鞣制后具有凹陷或空洞而造成巨大的经济损失，对养牛业危害巨大。该病于1929年在非洲赞比亚地区首次发现，随后50年里该病仅在非洲大陆广泛传播。1943年传播至波扎那，然后传入南非，引起800万头牛只发病，造成了重大的经济损失。1957年肯尼亚出现该病并大流行。1971年苏丹出现改变后，LSD跳过撒哈拉沙漠，1974年在乍得、尼日尔和尼日利亚被发现；1976年到达象牙海岸，接下来LSDV一直在非洲大陆周期性的暴发。1977年毛利达利亚、加纳、利比里亚均有该病的报道。1981~1986年，坦桑尼亚、肯尼亚、津巴布韦、索马里均有发生该病，死亡率在20%左右。1989年LSDV从非洲大陆传入中东的以色列，并不断蔓延至该地区的科威特、巴林等10多个国家。2013年LSDV传入土耳其并在其国内扩散而成为地方流行性疾病；2014-2015年LSDV在中东地区继续扩散，相继传入伊朗和沙特，以及阿塞拜疆和亚美尼亚等高加索国家。2015年LSDV再次跨州传播，传入欧洲的希腊和俄罗斯；2016年LSDV在欧洲继续蔓延，先后传入保加利亚、马其顿、塞尔维亚、阿尔巴尼亚和黑山等国家，引起了全球关注。2015年-2016年欧洲7个国家累计报告疫情1455起，发病牛达20183头，其中，俄罗斯报告的LSDV疫情数和病例数最多。上述报道表明，LSDV传入我国的风险极大。我国境内尚未发生LSDV。鉴于我国与发病国家的贸易和人员往来日益频繁，LSDV在全球进一步扩散的形式、对LSDV认识和研究还存在许多未知等情况，而国内对该病毒的研究尚不足，因此，为了防止该病毒通过从国外引进种畜或进口肉制品等途径而进入我国，在进境时加强对肉制品中牛结节性皮肤病病毒的检测显得尤为重要。荧光定量PCR技术是一种快速、准确的检测方法，且具有高特异性、高敏感性和稳定性。而MGB探针是一种新型的探针，3’端经特殊处理的高特异性探针，能检测模板结合区甚至1个碱基的突变基因，且本底荧光信号低，准确率高。由于羊痘病毒属病毒（牛结节性皮肤病病毒、山羊痘病毒、绵羊痘病毒）其同源性非常高，可达96%以上，非常难鉴别。而牛结节性皮肤病病毒疫苗株与野毒株之间的差异则更小，鉴别牛结节性皮肤病病毒疫苗株与野毒株是当前检测领域非常难的问题之一。本针专利技术针对TaqManMGB探针的优点，可以鉴别1个碱基的突变基因，通过对LSDV野毒株特异性保守序列与疫苗株的差异性进行深入分析，筛选，创新性的设计了特异性引物和TaqManMGB探针，首次建立了特异性强、敏感性高、稳定性好的鉴别牛结节性皮肤病病毒野毒株的荧光定量检测方法。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭基团则在3’端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光信号与3’端基团接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发射荧光。一分子的产物生产将会伴随一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断的积累。因此，TaqMan探针检测的积累荧光。目前，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有高特异性与高敏感性。TaqMan-MGB探针是近年来专利技术的一种新型探针，它的淬灭基团是一种非荧光的淬灭基团，本身不会发生荧光，这样就降低了PCR反应的荧光本底信号的强度，进一步提高了其敏感性和特异性。
技术实现思路
为克服上述现有技术的不足，本专利技术的第一个目的是提供一种牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，第二个目的是提供使用该引物进行牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测的试剂盒，第三个目的是提供使用上述试剂盒的检测方法，该检测方法用于对进口肉制品中牛结节性皮肤病病毒的检测。为了实现上述第一个目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术检测用引物包括牛结节性皮肤病病毒野毒株上游引物，其DNA序列为SEQIDNO.1；牛结节性皮肤病病毒野毒株下游引物，其DNA序列为SEQIDNO.2；牛结节性皮肤病病毒野毒株MGB探针，其DNA序列为SEQIDNO.3。为实现上述第二个目的，本专利技术采用如下技术方案：一种牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：所述扩增反应液管包括以下反应液：序列为SEQIDNO.1的10μmol/L牛结节性皮肤病病毒野毒株上游引物0.5μL；序列为SEQIDNO.2的10μmol/L牛结节性皮肤病病毒野毒株下游引物0.5μL；序列为SEQIDNO.3的10μmol/L牛结节性皮肤病病毒野毒株MGB探针1.0μL；2xpremixExTaq(probePCR)缓冲液8.0μL；灭菌去离子水9.0μL；19μL，为单次反应的用量。所述阳性对照管：管内为牛结节性皮肤病病毒野毒株阳性重组质粒DNA，体积为50μL；所述阴性对照管：管内为无牛结节性皮肤病病毒野毒株感染的牛组织基因组DNA，体积为50μL；所述灭菌去离子水管：1000μL。为实现上述第三个目的，本专利技术提供一种牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：（1）制备待检测样品模板DNA：选用商品化的组织或血液DNA提取试剂盒，提取待测样品的基因组DNA或病毒DNA，获得待检样品模板DNA。（2）扩增反应体系为：19μL扩增反应液，1μL待检样品模板DNA或阳性对照或阴性对照，反应体系总体积为20μL。（3）实时荧光定量PCR扩增，将步骤2)配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，扩增反应条件：95℃30s，1个循环；95℃5s，56℃34s（FAM，使用ABI7500Fast建议采用34s），45个循环，在56℃34s进行荧光信号采集。（4）结果判定：将扩增反应在40个循环内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，40个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增曲线明显，阴性对照没有扩增。反之，阳性质控未出现目的条带或阴性对照出现条带，则结果无效。本专利技术的原理是：针对一段靶序列保守区域本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan‑MGB实时荧光定量PCR检测用引物及探针，其特征在于，包括：牛结节性皮肤病病毒野毒株上游引物，其DNA序列为 SEQ ID NO.1；牛结节性皮肤病病毒野毒株下游引物，其DNA序列为 SEQ ID NO.2；牛结节性皮肤病病毒野毒株MGB探针，其DNA序列为 SEQ ID NO.3。

【技术特征摘要】
1.牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用引物及探针，其特征在于，包括：牛结节性皮肤病病毒野毒株上游引物，其DNA序列为SEQIDNO.1；牛结节性皮肤病病毒野毒株下游引物，其DNA序列为SEQIDNO.2；牛结节性皮肤病病毒野毒株MGB探针，其DNA序列为SEQIDNO.3。2.牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用试剂盒，包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其特征在于：所述扩增反应液管包括以下反应液：序列为SEQIDNO.1的10μmol/L牛结节性皮肤病病毒野毒株上游引物0.5μL；序列为SEQIDNO.2的10μmol/L牛结节性皮肤病病毒野毒株下游引物0.5μL；序列为SEQIDNO.3的10μmol/L牛结节性皮肤病病毒野毒株MGB探针1.0μL；2xpremixExTaq缓冲液8.0μL；灭菌去离子水9.0μL；19μL，为单次反应的用量；所述阳性对照管：管内为牛结节性皮肤病病毒野毒株阳性重组质粒DNA，体积为50μL；所述阴性对照管：管内为无牛结节性皮肤病病毒野毒株感染的牛组织基因组DNA，体积为50μL；所述灭菌去离子水管：1000μL。3.根据权利要求2所述牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于：所述阳性重组质粒DNA按如下步骤获得：...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂福平，王昱，杨俊，李贤良，王国民，李应国，
申请(专利权)人：重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：重庆,50