HLA分型用寡核苷酸芯片的制备及用法制造技术

ＨＬＡ分型用寡核苷酸芯片的制备及用法涉及针对ＨＬＡ基因设计不同的寡核苷酸探针，以玻璃载玻片为固相载体，将合成的寡核苷酸探针按一定排列方式结合于玻片表面，用于对ＨＬＡ基因进行分型，以及该方法的试剂组成与在临床和科学研究中的应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
HLA基因复合体位于人类第6号染色体6p21.3区域，具有高度的多态性。它在抗原识别与提呈、免疫应答与调控等方面起着极其重要的作用，是影响器官移植物长期存活和造血干细胞移植成败的关键因素之一(曹孟德主编，HLA分子生物学及临床应用，河南医科大学出版社，1998)。HLA存在多个基因座位，在所有HLA基因座位中，以A、B、DR座位对移植的影响最大。HLA-A、B属于I类抗原，其多态性主要集中在基因的第二、第三外显子；HLA-DRB1属于II类抗原，其多态性主要集中在基因的第二外显子。由于HLA抗原的高度同源性，传统的血清学分型方法会出现较多的交叉反应，造成分型的困难(Bodmer TG，Marsh SGE，Albert ED，et al.Vox Sang 1997，73105-130；Otten HG，Tilanus MG，Barnstiji M，et al.Tissue Antigens 1995，4536-41)。目前国际上越来越倾向于采用DNA分型方法代替传统血清学分型。DNA分型方法主要有五种，即DNA-限制性片段长度多态性分析(DNA-RFLP)、PCR-序列特异性引物法(PCR-SSP)、PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、PCR-DNA测序及PCR-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)法(Wake C，Long E，Mach B，et al.Nature 1989，300372-374；Uryn N.Tissue Antigens 1990，3520-32；Olerup O，Zetterquist H.Tissue Antigens 1992，39225-235；Pera C，Dffins L，Marabito A，et al.Tissueantigens 1997，50372-379)。为配合HLA分型的标准化，国际组织相容性学会(IHWC)选择PCR-SSOP作为重点推广的方法之一。SSOP是人工合成的具有HLA型特异性的探针，与PCR扩增的HLA基因片段在一定条件下特异性杂交，通过放射自显影判断结果。PCR-SSOP法一般是将PCR扩增的DNA片段点样在许多小块尼龙膜上，然后再将不同种类的放射标记探针与之杂交，最后根据阳性探针的不同组合得出HLA基因的型别(Peponnet C，Schaeffer V，Lepage V，et al.Tissue antigens 1995，45129-138；Bugawan TL，Apple R，Erlich HA.Tissue antigens 1994，44137-147)。不难看出，PCR-SSOP法也较为烦琐，无法实现HLA分型的高通量。寡核苷酸芯片技术是新近发展起来的一种基因检测技术，它可以将成百上千个寡核苷酸探针有规律地排列在一张很小的玻片上，这些探针可与放射性标记或荧光素标记的样品DNA中的互补序列相结合，通过放射自显影或荧光检测，对杂交结果进行计算机软件处理分析，从而获得杂交信号的强度及其分布模式图。本专利技术正是在利用PCR-SSOP思路的基础上，将经过选择的探针点样于玻片上，分别与PCR扩增的HLA-A、B基因的2，3外显子以及HLA-DRB1基因的2外显子产物进行杂交，一次性地获得各位点的多态情况，从而实现对HLA-A、B、DRB1基因的快速、简捷、高通量分型。目前国内外还没有一种方法利用玻片为载体将寡核苷酸探针固相化于其表面，用以对HLA基因进行分型检测的报道。本专利技术的目的是针对HLA-A基因设计了一套探针(见表1)；针对HLA-B基因设计了一套探针(见表2)；针对HLA-ADRB1基因设计了一套探针(见表3)。分别将用于HLA-A、B、DRB1基因分型的成套探针系统共价固相化于玻片表面不同区域，制作成三种不同的HLA寡核苷酸芯片，并提供包含试验操作所必需的所有组份，组成了一套完整的试剂盒。分别用于HLA-A、B、DRB1基因分型检测。另外，本试剂盒由于采用高密度点样技术，荧光引物标记技术以及激光共聚扫描技术，使试剂盒的操作大为简化，比传统的检测方法的效率大大提高。本专利技术的主要内容是分别以一条经测序已确定型别的标准HLA基因为模板，采用1∶15摩尔浓度比的引物，行不对称PCR扩增，PCR产物避光4℃保存。0.2％SDS和蒸馏水各洗涤HLA芯片2分钟，晾干。1ul荧光标记PCR产物和9ul杂交液(5×SSC，0.1％SDS)混合，均匀加入芯片杂交区。将芯片放入杂交盒，适当温度杂交1小时。依次在洗涤液A，B，C液中浸泡芯片各3分钟，取出晾干。使用Scanarray 3000荧光扫描仪，在85％激光强度下扫描3遍。分析阳性探针组成，判断HLA基因的型别。本专利技术的实施实现了对HLA-A、B、DRB1基因快速、简捷、高通量分型，具有重大的社会和经济效益。本专利技术用下列实施例进行解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本专利技术。下面结合附图说明本专利技术的具体实施方法图1芯片外观图2HLA-A分型芯片杂交结果示例图3HLA-B分型芯片杂交结果示例图4HLA-DRB1分型芯片杂交结果示例B6 AGCGGAGCGCGGTGCGCA18exon256B7 CGGAACCTGCGCGGCTAC18exon259B8 CGGACCCTGCTCCGCTAC18exon259B9 CGGATCGCGCTCCGCTAC18exon259B10ACACCGCCATGTCCCGGC18exon259B11GCTTCATCACCGTGGGCT18exon259B12CGTGGACGGCACCCAGTT18exon259B13GGACGACACCCAGT TCGT 18exon259B14TCCGAGAGGGGAGCCGCT18exon259B15CCGAGGACGGAGCCCCGG18exon259B16GAGGATGGCGCCCCGGGC18exon259B17GCCGTGGGTGGAGCAGGA18exon259B18GGGCGCCGTGGATAGAGC18exon259B19GGGACCGGAACACACAGA18exon259B20GGGACCGGGAGACACAGA18exon259B21AAGGCCCAGGCACAGACT18exon259B22ACAGATCTCCAAGACCAA18exon259B23CACACTTGGCAGACGATG18exon359B24TCTGCCAAGTGTGAGACC18exon359B25CAGAGCATGTACGGCTGC18exon359B26CAGAGGATGTACGGCTGC18exon359B27GACCTGGGGCCCGAC 15exon359B28CATAACCAGTACGCCTACG 18exon359B29TAACCAGTTAGCCTACGA18exon359B30GGGCATGACCAGTCCGCC18exon359B31ATAACCAGTTCGCCTACG18exon359B32GGCCCGTGAGGCGGAGCA18exon359B33CGGAGCAGGACAGAGCCT18exon359B34GCAGCTGAGAGCCTACCT18exon3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＨＬＡ基因中分辨率分型方法，其特征在于：按一定排列方式将用于ＨＬＡ基因分型的探针点样固化于经特殊处理的玻片片基上，用信号分子标记作信号显示，用于临床和血站对人群ＨＬＡ基因进行分型。试剂盒组份如下：检测用片基、信号标记系统、寡核苷酸探针、各种引物、洗涤液、点样液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王升启，蓝轲，胡守旺，张帆，王晖，丁雨，管伟，耿永尧，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所，深圳益生堂生物企业有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]