提高DNA检测灵敏度的方法技术

本发明专利技术涉及基于ＤＮＡ碱基配对原理上的一种提高灵敏度的检测ＤＮＡ杂交与错配的方法。分别采用不同粒径的纳米金颗粒作为石英晶体微天平（ＱＣＭ）的表面处理剂和作为ＤＮＡ检测器的识别放大器。通过双官能团的连接剂对石英晶体微天平金属表面的修饰，将纳米金属颗粒固定在ＱＣＭ表面上，然后将单链ＤＮＡ探针固定在这个用纳米金属颗粒修饰的表面上，该ＤＮＡ探针与待测定的靶标ＤＮＡ单链杂交，靶标ＤＮＡ比探针长，其一部分与探针ＤＮＡ互补，固定在石英晶体微天平上，另一部分与连结有纳米金属颗粒的互补ＤＮＡ单链配对，以增大其重量，从而提高石英晶体微天平对靶标ＤＮＡ的检测灵敏度。此方法其检测灵敏度可达到１０＃＋［－１６］Ｍ以上。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于DNA检测领域，特别涉及基于DNA碱基配对原理上的一种提高灵敏度的检测DNA杂交与错配的方法。
技术介绍
近年来，基因分析广泛应用于医学，法学，环境等诸多领域，成为科学研究的热点。如何从分子水平上检测基因突变，快速而灵敏的检测到基因突变的数量，从而为寻找基因突变与病变之间的相关性提供基本数据一直是人们研究的主要议题。因此开发一种简便、经济的快速检测微量基因突变的手段显得十分的重要和迫切。石英晶体微天平(QCM)可以适时的检测DNA，方法快速简便，但是目前这种方法灵敏度还比较低，无法达到临床应用的程度，因此限制了这种方法的推广，如.Payolsky，F.；Lichtenstein，A.；Willner，I.J.Am.Chem.Soc.2001，123，5194-5205；.Bardea，a.；Dagan，A.；Ben-Dov，I；Amit，B.；Willner，I.Chem.Commun.1998，839；.Payolsky，F.；Lichtenstein，A.；Willner，I.J.Am.Chem.Soc.2000，122，418-419所报道的。有鉴于此，本专利技术人等曾经利用过包以DNA单链的纳米金颗粒来增大此类DNA传感器的灵敏度，如.Zhao，H.Q.；Lin，L.；Li，J.R.；Tang，J.A.；Duan，M.X.；Jiang，L.Journal of NanoparticleResearch 2001，3，321；.Lin，L.；Zhao，H.Q.；Li，J.R.；Tang，J.A.；Duan，M.X.；Jiang，L.Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，274，7；.Zhao，H.Q.；Lin，L.；Tang，J.A.；Duan，M.X.；Jiang，L.Chinese science Bulletin 2001，13，1074。并且在国外也有类似的报道，如.Patolsky，F.；Ranjit，K.T.；Lichtenstein，A.；Willner，I.Chem.Commun.2000，1025；.Zhou，X.C.；O’Shea，S.J.；Li，S.F.Y.Chem.Commun.2000，953；.Weizmann，Y.；Patolsky，F.；Willner，I.Analyst.2001，126，1502。利用包以DNA单链的纳米金颗粒来增大此类DNA传感器的灵敏度，这种方法收到了很好的效果，其DNA检测灵敏度能达到10-14mol/L，而且具有易于安装，价格低廉等优点。在利用包以DNA单链的纳米金颗粒的放大效应时，发现这一效应与金属颗粒尺寸有关，当颗粒尺寸在50nm以下时，颗粒愈大，效应愈明显，但当颗粒尺寸大于50nm时，其放大效应将逐步消失。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服纳米金颗粒作为DNA传感器增感放大器时，增感颗粒重量的增加所带来的DNA检测灵敏度下降的问题。本专利技术利用纳米金属颗粒在QCM表面的固定技术，提高DNA探针在QCM表面的固定量和牢固度，实现了DNA的检测极限降低到10-16mol/L以下，提供了一种提高DNA检测灵敏度的方法。本专利技术的技术方案是这样实现的采用一定粒径的纳米金属颗粒作为石英晶体微天平(QCM)的表面处理剂和作为DNA检测器的识别放大器，重点是利用这两种方法的结合来提高DNA检测灵敏度。以DNA的碱基匹配进行杂交的原理为基础，采用石英晶体微天平技术，利用双官能团化合物与QCM表面金属及金属纳米颗粒之间可以形成化学键来实现石英晶体微天平表面的纳米修饰和DNA探针的固定。利用金属纳米颗粒自身具有的大比重和生物相容性好的特点，把它作为重量传感器，来达到增感目的。将DNA杂交检测前对QCM表面的修饰和后续的倍增杂交两项技术相结合，使增感纳米颗粒的粒径范围进一步扩大，大大降低了DNA的检出极限。本专利技术包括双官能团化合物对QCM表面的修饰、纳米颗粒的连接、DNA探针在修饰的纳米金属表面的固定、探针与靶标DNA的杂交以及纳米颗粒的增感等几个步骤。本专利技术的提高DNA检测灵敏度的方法步骤为(1).双官能团化合物在石英晶体微天平表面的固定本专利技术人选用能与QCM的电极表面金属以及纳米金属颗粒同时作用的双官能团化合物分子作为连接剂，对石英晶体微天平表面做了修饰，以实现后续对纳米金属颗粒的组装。在保湿的密闭室中，将浓度为5×10-4mol/L的双官能团化合物连接剂滴加到清洁的QCM的电极表面上，浸泡30分钟左右后分别用乙醇或癸醇和二次重蒸水冲洗，自然晾干。经石英晶体微天平测试，有质量变化，说明顺利的完成了修饰。(2).纳米金属颗粒在石英晶体微天平表面的组装在保湿的密闭室中，将步骤(1)中固定有双官能团化合物连接剂的QCM的电极表面用金属纳米溶胶浸泡至吸附达到饱和，分别用缓冲溶液和二次重蒸水冲洗，自然晾干。经石英晶体微天平测试，有较大的质量变化，说明纳米金属颗粒成功的完成在QCM的电极表面的组装。当用金纳米颗粒做修饰时，通过对DNA探针固定量及对靶标DNA杂交率的考察，确定采用粒径为20nm的金颗粒对QCM的电极表面修饰，最有利于提高DNA的检测灵敏度。(3).DNA探针在修饰过纳米金属颗粒后的QCM的电极表面的固定在步骤(2)组装有纳米金属颗粒的QCM的电极片上，滴加摩尔浓度为10-5mol/L的DNA探针的缓冲溶液，在保湿的密闭室中放置一段时间后，分别用缓冲溶液和二次重蒸水冲洗，晾干后测定晶体震荡频率变化值；重复以上步骤，直到DNA探针在修饰过纳米金属颗粒后的QCM的电极表面达到吸附饱和。结果显示，DNA探针迅速吸附并固定在修饰过纳米金属颗粒后的QCM的电极表面，且在1小时左右达到吸附饱和状态，经测试发现，当用金纳米颗粒对QCM的电极表面进行修饰时，能将DNA探针在晶片上的饱和吸附量提高约为3～5倍。(4).DNA的杂交检测在保湿的密闭室中，在温度为15℃～65℃下，将浓度为10-16mol/L的互补DNA序列的待测靶标溶液滴加到经步骤(3)处理过的QCM的电极表面上进行探针DNA与靶标DNA的杂交，然后用缓冲溶液和二次重蒸水冲洗，并用石英晶体微天平检测其频率变化，得到有靶标DNA的QCM的电极晶片，待用。(5).纳米金属颗粒对DNA传感器的倍增在金属纳米颗粒溶胶中，加入含有与靶标DNA末端互补的DNA的磷酸缓冲溶液，静置若干时间，随后用磷酸缓冲溶液对其进行稀释，进一步放置40～60小时。然后高速离心移去上层清液，以除去未与纳米金属颗粒结合的DNA。沉淀物质即为DNA功能化的纳米金属颗粒。将下层沉淀用磷酸缓冲溶液清洗，再离心分离出沉淀。重复以上洗涤过程两次，然后将经过DNA功能化的纳米金属颗粒分散到缓冲溶液的容器里备用。在保湿的密闭室中，将用纳米金属颗粒功能化的的DNA滴加到步骤(4)中有靶标DNA的QCM的电极晶片上，在15℃～65℃下进行杂交后用缓冲溶液和二次重蒸水冲洗，并用石英晶体微天平分别检测其频率变化。本专利技术中用于固定纳米金属颗粒的双官能团化合物，其官能团分别可以为不同链长的双巯基、双氨基或各类一端带有巯基或氨基的醇类化合物，化合物的链长可以改变。所述的待测靶标DNA的长度可在17～25bp范围；DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高ＤＮＡ检测灵敏度的方法，其特征是：该方法的步骤为：（１）．双官能团化合物在石英晶体微天平表面的固定在保湿的密闭室中，将浓度为５×１０↑［－４］ｍｏｌ／Ｌ的双官能团化合物连接剂的溶液滴加到清洁的ＱＣＭ的电极表面上，浸泡后，分别 用乙醇或癸醇和二次重蒸水冲洗，自然晾干；（２）．纳米金属颗粒在石英晶体微天平表面的组装在保湿的密闭室中，将步骤（１）中固定有双官能团化合物连接剂的ＱＣＭ的电极表面用金属纳米溶胶浸泡至吸附达到饱和，然后分别用缓冲溶液和二次重蒸水冲洗， 自然晾干；（３）．ＤＮＡ探针在修饰过纳米金属颗粒后的ＱＣＭ的电极表面的固定在步骤（２）组装有纳米金属颗粒的ＱＣＭ的电极片上，滴加１０↑［－５］ｍｏｌ／Ｌ的ＤＮＡ探针的缓冲溶液，在保湿的密闭室中放置一段时间后，分别用缓冲溶液和二次重蒸水冲 洗，晾干后测定晶体震荡频率变化值；重复以上步骤，直到ＤＮＡ探针在修饰过纳米金属颗粒后的ＱＣＭ的电极表面达到吸附饱和；（４）．ＤＮＡ的杂交检测在保湿的密闭室中，在温度为１５℃～６５℃下，将浓度为１０↑［－１６］ｍｏｌ／Ｌ的互补ＤＮＡ序 列的待测靶标溶液滴加到经步骤（３）处理过的ＱＣＭ的电极表面上进行探针ＤＮＡ与靶标ＤＮＡ的杂交，然后用缓冲溶液和二次重蒸水冲洗，并用石英晶体微天平检测其频率变化，得到有靶标ＤＮＡ的ＱＣＭ的电极晶片，待用；（５）．纳米金属颗粒对ＤＮＡ传感器 的倍增在金属纳米颗粒溶胶中，加入含有与靶标ＤＮＡ末端互补的ＤＮＡ的磷酸缓冲溶液，静置，随后用磷酸缓冲溶液对其进行稀释，进一步放置；然后高速离心移去上层清液，以除去未与纳米金属粒子结合的ＤＮＡ；沉淀物质即为ＤＮＡ功能化的纳米金属颗粒，将下 层沉淀用磷酸缓冲溶液清洗，再离心分离出沉淀；重复以上洗涤过程，然后将经过ＤＮＡ功能化的纳米金属颗粒分散到缓冲溶液的容器里备用；在保湿的密闭室中，将功能化的纳米金属颗粒的ＤＮＡ滴加到步骤（４）中有靶标ＤＮＡ的ＱＣＭ的电极晶片上，在１５℃～６５℃下进行杂交后用缓冲溶液和二次重蒸水冲洗，并用石英晶体微天平分别检测其频率变化；所述的缓冲溶液是磷酸缓冲溶液，其ｐＨ＝６．８３。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：江龙，唐季安，刘涛，
申请(专利权)人：中国科学院化学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]