含有NOS终止子转基因作物核酸扩增用引物序列制造技术

本发明专利技术提供了含有ＮＯＳ终止子转基因作物核酸扩增用引物序列，这些序列分布在两对最优引物的延伸区域范围内，所述两对引物中的每一对延伸区域范围是，引物对的上游引物位置后延１０个碱基，而下游引物位置前延１０个碱基，后延１０个碱基，在上述引物对的上下游延伸位置的区域范围内得到的引物序列。本发明专利技术对最优引物对做荧光ＰＣＲ检测，检测灵敏度可达０．１％，而非转基的农产品大豆、玉米等均无扩增信号，说明这些引物是有良好的灵敏度和特异性，可用于转基因作物的定性筛选。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种含有NOS终止子转基因作物核酸扩增用引物序列
技术介绍
最近三四年来，转基因产品的检测成为国内外一件重大事件，引起社会各界的广泛关注和重视。虽然联合国所属机构(FAO、WHO等)及一些地区性国际组织在召集建立世界统一的检测技术和方法标准，但由于对于转基因产品的安全性、风险管理措施及其它利益等方面的不一致，目前各国尚难达成一致的意见。综合世界各国转基因产品的检测技术，根据检测目标主要分成下面三个类型检测插入的外源基因，检测外源基因表达物(RNA或蛋白质)，检测插入外源基因对受体生物基因表达的影响(主要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对整个代谢产物的影响)。由于第三类型的检测成本高、所需时间长，并且被认为重要性较低，目前对这方面的检测在实际工作中较少涉及。在前两种类型的检测工作中所涉及的检测目标包括三种类型DNA、RNA和蛋白质。对于蛋白质的检测主要用血清学方法，由于有些转基因产品不表达蛋白质或表达量不稳定，血清学检测方法仅在个别转基因产品检测中应用。对于DNA和RNA的检测主要采用PCR及直接核酸杂交等基因诊断技术。基因扩增诊断方法到目前为止已经历了以下几个方面的发展PCR/电泳检测、传统杂交或测序；PCR-ELISA；实时荧光PCR。国内外所有的检测方法并没有完全解决转基因产品的检测问题，新的检测方法在不断出现，并在继续完善之中。首先，目前国内外常用的几套筛选引物，不能完全检测出目前已商品化的转基因品种；传统的的PCR技术较难控制污染的产生；另外，质量不过关的检测试剂，经常影响检测结果的判断和检测出证工作。到目前为止，最有发展前途的检测技术为实时荧光PCR技术。实时荧光PCR技术具有很多优点使用了杂交探针，提高了检测的准确性；荧光检测的高灵敏度；不用对PCR产物后期处理，较好地降低了检测过程中的污染；边扩增边检测，提高了检测速度；可以使用国际标准品对检测样品进行定量。这个技术的核心环节是首先要获得能高效、特异并灵敏地扩增目的片断DNA的引物。据国际农业生物技术应用咨询服务中心(ISAAA)统计，2001年全世界转基因作物种植面积为5260万公顷，十多个国家已种植转基因作物，其中99％的转基因作物种植在美国、阿根廷、加拿大和中国，已批准商品化转基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、香石竹、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜、菊苣等。据估计，用这些转基因作物生产加工的食品全世界有近万种。对转基因产品的安全性，特别是转基因食品对人和动物的健康及对生态环境的影响，自转基因技术出现以来，就一直是世界各国及联合国等国际组织关心的焦点问题，2000年联合国通过了“生物安全议定书”，该议定书对除了药物以外的所有进出境活性转基因生物有关过境、审批、检测、风险评估和管理、赔偿责任等做出了详细的规定，其中最重要的措施之一就是对转基因产品要进行检验，以明确其种类，确定是否为已批准的或已获得许可的转基因产品，以防止一些具有风险的转基因产品任意扩散，造成不可挽回的损失。2001年欧盟要求对转基因食品进行标识管理，并提出只要不是有意污染，食品中含有不超过1％的转基因产品(阈值)则不用标识，这样转基因产品检测不但需要定性，还需要定量检测。不同国家阈值大小不一样，从1-5％不等。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，并于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法。目前全世界36个国家和地区出台了各种转基因产品有关的法律法规。总之，转基因产品的研究、生产、销售都要在政府有关部门的许可和监督下，在特定的环境和地点进行。事实上，最近几年已先后发现转基因产品研究、生产及进出口过程中出现安全及监管事故，存在各种各样的转基因产品扩散、污染及安全隐患，加大对转基因产品的检测监管是非常必要的。2002年欧盟执行新的转基因产品管理法规，要求对转基因产品从生产、运输、保存、销售进行全程的“跟踪”、检测，以保证转基因产品不污染非转基因产品。美国提出了品种“个性保存”方案，所不同的是要求对非转基因产品从生产、运输、保存、销售进行全程的“跟踪”检测，以确保非转基因产品不被转基因产品污染(事实上完全不被污染是不可能的，但要控制在一定的许可范围之内)。许多国家对进口非转基因食品，要求出口商提供经检测合格的非转基因产品证明。综上所述，转基因食品从研究、生产、贮存、运输、销售、进出口等环节都需要检验监控，不但要求检测出是否含有转基因，而且要检测出转基因产品的含量。对转基因产品的检测，主要想解决如下几个方面的问题是否为转基因产品；如果含有转基因产品、又是某国已批准商品化的转基因产品，则要检测出转基因产品的含量是否达到允许值；如果是尚未批准的转基因产品，原则上不允许进口或销售。所有这些都离不开确实可靠的GMO检测方法。一个好的GMO检测方法首先要有较广泛的GMO针对性。虽然转基因作物的获得性状的多种多样，但为了使转入的基因成功表达，均需要插入一定的外源性调控序列，例如启动子、终止子等等。NOS终止子(或其人工改建序列)就是一种最常见的插入序列，许多转基因作物均含有该序列。因此，NOS终止子成为GMO检测的一个理想的标志性DNA序列。一个好的GMO检测方法首先要有较广泛的GMO针对性，虽然转基因作物的获得性状多种多样，但为了使转入的基因成功表达，均需要插入一定的外源性调控序列，例如启动子、终止子等等。NOS终止子(或其人工改建序列)就是一种最常见的插入序列，在转基因作物中普遍存在。因此，NOS终止子成为GMO检测的一个理想的标志性DNA序列。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案一种含用NOS终止子转基因核酸扩增用引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物Nor-U序列为ATCGTTCAAACATTTGGCA和下游引物NOS-R序列为ATTGCGGGACTCTAATCATA组成的引物对，该引物对的上游引物位置后延10个碱基得到NOS2786，而下游引物位置前延10个碱基得到NOS2910，后延10个碱基得到NOS2930，在上述引物对的上下游延伸位置的区域范围内得到的引物序列。一种含用NOS终止子转基因核酸扩增用引物序列，其特征在于所述的引物序列包括；由上游引物NOS2762u，序列CCCGATCGTTCAAACATTTGGC和下游引物NOS2886r序列AACCCATCTCATAAATAACGTCA组成的引物对，该引物对的上游引物位置后延10个碱基，而下游引物位置前延10个碱基，后延10个碱基，在上述引物对的上下游延伸位置的区域范围内得到的引物序列。引物序列有NOS-UATCGTTCAAACATTTGGCANOS-RATTGCGGGACTCTAATCATANos2762uCCCGATCGTTCAAACATTTGGCNos2886rAACCCATCTCATAAATAACGTCA(NOS全序列见附录一)具体实施方式附图说明图1利用荧光PCR筛选引物荧光变化图谱图2利用nos-U/nos-R引物扩增不同农作物DNA的荧光变化图谱图3nos-终止子引物(nos-U/nos-R)扩增转基因油菜DNA电泳图引物设计 对GMO中选用的多种NOS终止本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含用ＮＯＳ终止子转基因核酸扩增用引物序列，其特征在于所述的引物序列包括：由上游引物Ｎｏｒ－Ｕ序列为ＡＴＣＧＴＴＣＡＡＡＣＡＴＴＴＧＧＣＡ和下游引物ＮＯＳ－Ｒ序列为ＡＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＣＴＡＡＴＣＡＴＡ组成的引物对，该引物对的上游引物位置后延１０个碱基得到ＮＯＳ２７８６，而下游引物位置前延１０个碱基得到ＮＯＳ２９１０，后延１０个碱基得到ＮＯＳ２９３０，在上述引物对的上下游延伸位置的区域范围内得到的引物序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文斯，黄茜华，朱水芳，
申请(专利权)人：深圳市匹基生物工程股份有限公司，国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]