测定血红素突变基因的方法及使用此方法的固态基材技术

一种测定血红素突变基因的方法，是在检体的血红素基因中，可同时检测多种基因缺失突变。另外，本发明专利技术进一步提供一种使用此方法的固态基材，是包含多种专一性的探针，以便对于常出现于亚洲族群的血红素基因突变，做特定的筛选。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于一种测定血红素(hemoglobin)突变基因的方法，更明确地是，本专利技术是一种测定血红素中α血球蛋白基因(α globin gene，以下简称α基因)-α3.7、-α4.2、SEA、FIL、THAI突变型的方法，并进一步包含使用此测定方法的固态基材。海洋性贫血形成的主要原因为构成红血球之血红素合成发生问题，正常血红素的合成是由四条血球蛋白链(globin chain)2条α链及2条β链所构成，而当控制α链或β链生成的基因发生问题时，便会造成血红素的合成发生问题，进而产生贫血的现象，临床症状可从全无症状到致命的重度贫血。海洋性贫血可分为两大类α型海洋性贫血及β型海洋性贫血。α型海洋性贫血多为基因缺失(deletion)所致，β型海洋性贫血则是基因突变(如点突变、基因缺失、或插入基因)所致，α型和β型海洋性贫血两者皆是独立遗传，所以有的人可能同时遗传到两型海洋性贫血。对于α型海洋性贫血而言，全台湾约有100万人带有α型海洋性贫血的致病基因，若有两个带因者结婚，胎儿就有1/4的机会为罹患中度至重度α型海洋性贫血的水肿新生儿，而可能于妊娠末期在子宫内死亡，或者出生后不久，即因肺部发育不良及严重贫血缺氧死亡。为了落实优生保健，节省社会成本，所以婚前健康检查及早期的产前诊断相当地重要。已知的海洋性贫血检测，通常采用Hb电泳、等电焦距、高效液相色谱分析和胺基酸分析测序等关于血液学上的检定结果，像是在血液常规检查中，如果平均红血球体积(MCV)和平均血红蛋白量(MCH)皆显著偏低，则可能为海洋性贫血带因者。值得注意的是，因为α型海洋性贫血是小血球性贫血，临床上除了红血球体积较小外，大部份的带因者并无其它症状。但是，其它的疾病，像是缺铁性贫血、慢性疾病、含铁母细胞性贫血也会造成小血球性贫血，造成诊断病因上的不确定。近年来，随着分子生物学技术的进步，已可直接从α型海洋性贫血带因者体内选殖出(cloning)α血球蛋白基因，并对α血球蛋白基因作进一步定序。最近，已发现一些缺失性突变会导致海洋性贫血的表现型，而这些表现型会与特定的片段缺失有关联。所以，随着DNA分析技术的不断发展，使用基因型检查是可对α型海洋性贫血有较佳确认诊断，从而对揭露其发病原理、有效监控此类疾病、提高人口素质有重要意义。在人体内HBA1基因(hemoglobin，alphal gene，以下称为α1基因)及HBA2基因(hemoglobin，alpha2gene，以下称为α2基因)是专司表现α血球蛋白之基因，同时位于第16条染色体上。绝大多数的α型海洋性贫血，是因缺少至少一个以上的α基因片段所致，见Kazazian(1990)，supra；Embury et al.(1980)。例如-α3.7突变型便是α2和α1基因片段部份缺失，其缺失片段长度约为3.7千碱基(kilobase，kb)。若是个体所遗传到的异型结合子(heterozygotes)中的第16对染色体上，有一条是-α3.7缺失的染色体，一条为正常的染色体，此种情况可以用-α3.7/αα来表示。另外，-α4.2突变型则是α2基因向左缺失了4.2千碱基的片段，可以用-α4.2/αα来表示。在整个美国的族群中，-α4.2/αα的基因型是很少见的(Higgs et al.(1989))，但在某些中国人的族群中约有58％有此种基因型(Baysal and Huisman(1994))。为了研究疾病背后的基因异常组合，且探测这些基因的缺失片段，便发展出各式的聚合酵素链锁反应(PCR)，见Innis et al.，PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications.San DiegoAcademic Press(1990)。使用PCR来放大DNA或病变基因的部分片段，以协助了解被放大部分的特性。不过，当PCR技术放大(amplify)出来的产物已非常干净的同时，有部分(Dode et al.(1990)；Lebo et al.(1990))在分析之前，仍需要使用限制酵素切割放大的产物，才能达到适当的效果。另外，上述的方法中，并未在使用定量PCR(Quantitative PCR)时，能客观及可信赖地辨别出同型结合子(homozygotes)、杂合子(heterozygotes)及正常型之间的差别，见Lundeberget al.(1991)；Lubin et al.，Mol.Cell.Probes，5307-17(1991)。所以，在测定α血红素蛋白突变基因上，目前需要一种快速且花费较少的改良方法，且能够准确地分别出α血红素蛋白的各种基因型。上述提到以聚合酵素链锁反应(PCR)为基础的各种方法中，使用于基因诊断例如有缺口PCR(Gap-PCR)，其原理是，设计的引子和缺失序列的两侧端序列互补，由于缺失两端相接，使本来在正常DNA序列中相距很远的这一对引子之间的距离，因断端连接而靠近，以至于能扩增出特定长度的片段。另外一对引子则设计位于缺失区域，这样仅在杂合子或完全正常的情况下，其中的正常等位基因才会扩增出来。此法可以检出大片段缺失的杂合子，如东南亚国家常见的SEA型。此法针对分析突变型-α3.7和-α4.2会有相当地困难度。因在第16条染色体上的α基因群区存在着大量同源序列，对设计PCR引子造成困难并会影响反应的结果。另外，还有一种用于诊断基因的聚合酵素链锁反应为多重PCR(Multiplex PCR)，其原理为同时引入数对引子，使数个PCR得以在同一反应体是中完成。现已能用于同时诊断以下几种类型的突变(--SEA)、(--MED)、-(α20.5)(Bowden DK et al.BrJ Haematol，1992，81104)，或(--MED)(-α3.7)(Bowie IJ et al.Clin Chem，1994，40(12)2260)，或是(-α3.7)(-α4.2)(-MED)(Oron Karni V et al.Am J Hematol，1998，58306)，但并非所有的突变类型都能并在一起同时检测出，其中最大的困难是反应中的基因片段会彼此干扰，而大幅降低检测的准确度及可靠度。目前在α型海洋性贫血基因型检查方面，最常见的是基因电泳分析法利用聚合酵素链锁反应(PCR)将基因放大后，再由电泳结果判断，或用杂交方式进行确认，例如凝胶电泳法配合使用特定的探针，就可以测定未知片段的尺寸、核酸序列、以及杂交的研究，可参见Sambrook et al.，Molecular Cloning--ALaboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarborCold Spring Harbor Press(1989)。美国专利第6322981号中所揭示的检测血红素突变基因方法，是在聚合酵素链锁反应(PCR)过程中，藉由三种引子(primers)放大检体染色体的α1及α2基因，且与对照组的PCR产物量作定量方式比较，以间接推测是否有基因缺失。同样地，在美国专利第5750345号中所揭示的方法，则是以比较染色体三个位置PCR的产物量，而间接推测是否有基因缺失。上述对于基因缺失的检测方法，皆需加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于测定血红素突变基因方法中引子的核酸组成物，其特征在于，其中该引子是包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的核酸序列及ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２的核酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴满潮，杜明哲，黄献龙，赵守宇，
申请(专利权)人：晶碁生化科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]