一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法及其基因芯片与应用技术

本发明专利技术是一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法及其基因芯片与应用。该制备方法包括将均一化的cDNA文库的cDNA质粒和差减cDNA文库的cDNA质粒贮存在384孔板的孔中，并依次编号；用SSC作为阴性对照，用β-actin的cDNA为阳性对照，按编号顺序依次将所提取的均一化的cDNA文库的cDNA质粒和差减cDNA文库的cDNA质粒，阴性对照和阳性对照在一张载体上制成所述的基因芯片。该基因芯片中的cDNA类型更能全面反映与抗水稻白叶枯病有关的基因cDNA，在后续应用中保证最大限度地检测、筛选出抗水稻白叶枯病相关基因。其cDNA平均程度为500bp，应用时特异性更好，提高了检测利用效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属基因芯片
具体涉及一种检测应答水稻白叶枯病的基因芯片的制备方法及其基因芯片与应用。
技术介绍
水稻白叶枯病是仅次于稻瘟病的第二大世界性水稻病害，它的病原菌是黄单胞杆菌水稻致病变种0 / QTj^ae pv. oryzae, Zoo)，因此，在现有基因芯片先进技术的基础上，研究出一种适宜认识抗水稻白叶枯病的基因分子基础，发掘抗水稻白叶枯病的新基因及其相关基因，抗水稻白叶枯病的表达谱，分析抗病相关基因在病原菌处理前后的表达，抗水稻白叶枯病的机制研究的基因芯片的制备方法及其基因芯片，对培育高抗水稻白叶枯病的水稻新品种具有重要意义。基因芯片是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA 探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。目前基因芯片技术以其快速、高通量、大规模、高度自动化、高度并行性、高灵敏度等优点，已经在大规模DNA测序、基因表达分析、基因型筛选、基因突变及多态性检测、疾病的诊断及治疗、药物筛选、新基因的发现克隆及功能研究等领域得到了广泛的应用。基因芯片按所点DNA的种类不同可分为两种寡核苷酸微阵列和cDNA微阵列。寡核苷酸微阵列是指主要利用原位合成法或将已合成好的一系列寡核苷酸固定在介质上，制备成高密度的寡核苷酸阵列，寡核苷酸的长度随芯片用途不同而不同，但一般在50 bp以内，以8 25 bp为多。寡核苷酸微阵列密集程度高，一致性和可重复性好，但费用高、灵活性差，主要用于DNA序列测定、SNP分析等，也可用于表达谱研究。cDNA微阵列是指利用点样法制备的较低密度的玻片或尼龙膜芯片，芯片上固定的探针主要是cDNA片段。cDNA微阵列对靶基因检测的特异性好，技术相对简单、灵活性高，但重复性稍差，主要用于表达谱研究。根据芯片的功能可分为基因表达谱芯片和DNA测序芯片两类。基因芯片的制作方法主要有两种，一是Affymetrix公司采用的原位合成法，二是将PCR得到的cDNA、寡核苷酸片段等直接点样，又叫合成后点样。对于基因组序列己知的生物，可以直接根据序列设计全基因组基因芯片。用Array Designer软件设计引物，在合成DNA片段前用序列同源性搜索软件分析，保证扩增片段不与基因组其它序列杂交，通过PCR可以扩增获得代表每个ORF的 DNA片段，经纯化后可以点到玻片上。而对于基因组序列未知的生物，可以用DNA文库制备基因芯片。基因芯片技术已被广泛应用于基因差异表达检测，也被逐渐用成植物抗病机理研究手段。用基因芯片检测表达谱，能提供大量信息有助于阐明防御应答网络，可分析评价多种防御途径之间的交流，利于对抗病机制的了解和抗病候选基因的筛选。已有的基因芯片技术研究水稻抗病机制中，是以水稻基因组相关基因制作芯片，提取病原物侵染后水稻叶片组织的RNA，反转录成cDNA后再与芯片杂交、分析。但现有技术的cDNA微阵列的制备上还存在cDNA片段仅来自cDNA文库，使芯片中的cDNA质粒类型单一，不能全面反应待检测对象相关的基因的缺陷和不足，也还缺少一些重要材料如能免疫水稻白叶枯病的疣粒野生稻在应答水稻白叶枯病原菌处理(胁迫)后的cDNA微阵列基因芯片，制约了全面深入认识、 研究水稻抗白叶枯病的基因分子机制。疣粒野生稻(Miyza meyeriana)对水稻白叶枯病具有高度的抗病性，彭绍裘等用湖南白叶枯病强菌系对云南普通野生稻，药用野生稻，疣粒野生稻进行检测，发现疣粒野生稻抗性水平达到免疫级(彭绍裘等，“野生稻多抗(病)性鉴定——高抗白叶枯病的抗源-疣粒野生稻”，《湖南农业科学》1981年05期)，章琦等鉴定了三种野生稻对水稻白叶枯病的抗性，参试的13个野生稻种共871份材料，抗性测定结果表明多数野生稻种具有抗性优良的资源，就抗性水平而言，以疣粒野生稻最为突出，参试的疣粒野生稻全部高抗，整个生育期都表现高抗，甚至免疫(章琦，“水稻白叶枯病抗性的遗传及改良”。科学出版社2007 年9月，北京第1版。)，因此，进一步利用疣粒野生稻为材料制备应答水稻白叶枯病菌的基因芯片，对发掘抗水稻白叶枯病的新基因及其相关基因，研究疣粒野生稻抗水稻白叶枯病的机制，对于选育抗白叶枯病的水稻新品种具有重要意义和应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有制备cDNA芯片的cDNA类型单一，不能尽可能地包含与抗病相关的cDNA，使芯片在应用上不能够最大限度地把相关基因检测处理，另一方面，还没有基于疣粒野生稻能免疫白叶枯病能够提供更全面认识抗病分子机制的信息的基因芯片及其制备方法，其目的是提供一种适宜检测应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法及其基因芯片与应用。为解决上述技术问题和达到本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下本专利技术所提供的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法，包括以下步骤(1)构建cDNA文库以接种蒸馏水的水稻叶片和接种Ioo后Mh、48h、72h的水稻叶片作为总RNA的提取材料，构建cDNA文库；(2)均一化步骤(1)构建的cDNA文库；(3)构建差减cDNA文库以接种Ioo后24h、4 i、7ai、％h和120h的水稻叶片等量取材作为接种样品，以接种样品作为差减杂交的试验方(tester)，接种蒸馏水的水稻叶片等量取材作为驱动方 (driver)，构建差减cDNA文库；(4)将步骤(2)均一化的cDNA文库的cDNA质粒和步骤(3)差减cDNA文库的cDNA质粒，贮存在384孔板的孔中，并从第1块384孔板的第1个孔开始依次编号；用SSC作为阴性对照，用β-actin的cDNA为阳性对照，β-actin在GenBank库登录号是XM-469569. 1， 阴性对照和阳性对照在cDNA质粒之后依次贮存在384孔板的孔中，并依次编号；(5)重复步骤(4)提取cDNA质粒，按步骤(4)的编号顺序依次将所提取的cDNA质粒、 所述的阴性对照和阳性对照用生物芯片点样仪点在一张载体上，cDNA质粒不设重复，所述的阴性对照和阳性对照各设8个重复。步骤(5)所述的载体为玻片。步骤(1)和步骤(3)所述的水稻叶片为水稻孕穗期叶片。步骤(1)和步骤(3)所述的水稻叶片为疣粒野生稻meyeriana)叶片。所述的疣粒野生稻叶片为疣粒野生稻孕穗期的叶片。本专利技术所提供的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片，是用上述本专利技术所述的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法制备获得。本专利技术还提供了一种用本专利技术所述的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片在检测应答水稻白叶枯病菌基因及其相关基因表达的应用。所述的应用是将待检测水稻接种ibo，分别取接种Ioo后24h、4 i和72h的水稻叶片为三个处理，将三个处理按常规方法提取总RNA，将三个处理的总RNA等量混合后，在逆转录时用Cy5标记，以接种蒸馏水的待检测水稻的叶片为对照材料，将对照材料按常规方法提取总RNA，取对照材料的总RNA在逆转录时用Cy3标记，将标记Cy5的cDNA和标记 Cy3的cDNA按常规DNA杂交方法与本专利技术制备的一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片预杂交、杂交、进行图像处理和分析，将有杂交信号点所对应的克隆进行测序，将测序结果与 GenBank或Pro本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种应答水稻白叶枯病菌的基因芯片的制备方法，包括以下步骤：（１）构建ｃＤＮＡ文库以接种蒸馏水的水稻叶片和接种Ｘｏｏ后２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ的水稻叶片作为总ＲＮＡ的提取材料，构建ｃＤＮＡ文库；（２）均一化步骤（１）构建的ｃＤＮＡ文库；（３）构建差减ｃＤＮＡ文库以接种Ｘｏｏ后２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ和１２０ｈ的水稻叶片等量取材作为接种样品，以接种样品作为差减杂交的试验方，　接种蒸馏水的水稻叶片等量取材作为驱动方，构建差减ｃＤＮＡ文库；（４）将步骤（２）均一化的ｃＤＮＡ文库的ｃＤＮＡ质粒和步骤（３）差减ｃＤＮＡ文库的ｃＤＮＡ质粒，　贮存在３８４孔板的孔中，并从第１块３８４孔板的第１个孔开始依次编号；用ＳＳＣ作为阴性对照，用β－ａｃｔｉｎ　的ｃＤＮＡ为阳性对照，β－ａｃｔｉｎ　在ＧｅｎＢａｎｋ库登录号是ＸＭ－４６９５６９．１，阴性对照和阳性对照在ｃＤＮＡ质粒之后依次贮存在３８４孔板的孔中，并依次编号；（５）重复步骤（４）提取ｃＤＮＡ质粒，按步骤（４）的编号顺序依次将所提取的ｃＤＮＡ质粒、所述的阴性对照和阳性对照用生物芯片点样仪点在一张载体上，ｃＤＮＡ质粒不设重复，所述的阴性对照和阳性对照各设８个重复。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄兴奇，刘艳平，程在全，罗玉，晏慧君，余腾琼，钟巧芳，李维蛟，李定琴，殷富有，张敦宇，付坚，王玲仙，叶玉，蒋春苗，李娥贤，郭怡卿，王波，
申请(专利权)人：云南大学，云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，
类型：发明
国别省市：53