本发明专利技术涉及一种人类主要组织相容性复合体I类分子相关基因A基因测序分型方法及试剂盒，本发明专利技术的具体方法为：提取样品基因组DNA；设计PCR引物对样品进行基因组DNA的PCR扩增；设计测序引物对所获得的PCR扩增产物进行双向测序，分别对其中第1、2、3、4、5、6外显子进行正、反向双向测序；根据测序结果进行分型。该方法可以解决目前MICA基因进口商品化测序试剂盒仅有单向测序试剂盒，避免单向测序碱基信号强度不一致及不能清晰反应突变存在的缺点，解决MICA模棱两可基因分型结果，获得第1和第6外显子碱基序列。
【技术实现步骤摘要】
一种人类主要组织相容性复合体丨类分子相关基因A基因测序分型方法及试剂盒
本专利技术涉及测序分型方法，特别是涉及人类主要组织相容性复合体I类分子相关基因A(major histocompatibility complex class I chain related gene A,MICA)的测序分型方法。
技术介绍
人类主要组织相容性复合体I类分子相关基因A基因(MICA基因)位于人第6号染色体的短臂HLA-III类基因区，属于非经典HLA-I类基因家族的功能基因。 MICA基因全长11722bp(NM_000247)，编码1382bp的转录物。整个基因包括6 ^外显子(外显子1 6)，外显子1编码L前导肽，外显子2 构域，外显子5编码跨膜(TM)区，外显子6编码胞质区。 表1 MICA基因各外显子及内含子长度4分别编码细胞外α 1 3结权利要求1.一种人类主要组织相容性复合体I类分子相关基因A基因测序分型的方法，其特征在于，所述测序为双向测序，并还可以包括第1和第6外显子的测序。2.权利要求1所述的方法，其步骤为提取样品基因组DNA;设计PCR引物对样品进行基因组DNA的PCR扩增；设计测序引物对所获得的PCR扩增产物进行双向测序，分别对其中第1、2、3、4、5、6外显子进行正、反向双向测序；或者先对第2至第5外显子基因序列测序，根据结果再决定对第1至第6外显子测序；根据测序结果进行分型。3.权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增中用到了三对PCR扩增引物，其中第一对PCR扩增引物为第1外显子PCR扩增引物，其上游引物位于人类主要组织相容性复合体I类分子相关基因A基因的5'-启动子区域，包含了部分5’-启动子区，下游引物位于人类主要组织相容性复合体I类分子相关基因A基因的第1内含子区域；第二对PCR扩增引物为第2至第5外显子的PCR扩增引物，其上游引物位于第1内含区域，下游引物位于第5内含子区域；第三对PCR扩增引物为第6外显子的PCR扩增引物，其上游引物位于第5内含子区域， 下游引物位于3'-非翻译区UTR。4.权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增中用到的引物序列分别为扩增第一外显子的上游引物MICA-PCR-1-F1和下游引物MICA-PCR-1-R1，具体序列为SEQID NO :1 禾口 SEQ ID NO 2 ；扩增第2至第5外显子的上游引物MICA-PCR-2345-F10和下游引物 MICA-PCR-2345-R10，具体序列为:SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 ；扩增第6外显子的上游引物MICA-PCR-6-F4和下游引物MICA-PCR-6-R4，，具体序列为 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6。5.权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR扩增反应体系为基因组 DNA IOOng1 μ .10 χ Pfu Buffer2. 5 μ dNTP (2. 5mM)2. 5 μ PCR 正向引物(10 μΜ)0. 5μ PCR 反向引物(10 μΜ)0. 5μΙ PfuUltra fusion HS DNA polymerase (5 /μΟ 0. 5μΙ加 ddH20 至25 μ 或所述PCR扩增反应体系为6.权利要求4或5任一所述的方法，其特征在于第1外显子的PCR扩增片断长度为 47^p，第2至第5外显子的PCR扩增片断长度为2M9bp，第6外显子的PCR扩增片断长为 570bp。7.权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR测序扩增中用到的测序引物包括 第一外显子正向测序引物MICA-Seq-1-F，其序列为SEQ ID NO :7，反向测序引物MICA-kq-1-R，其序列为SEQ ID NO 8 ；第二外显子正向测序引物MICA-Seq-2-F，其序列为SEQ ID NO :9，反向测序引物 MICA-kq-2-R，其序列为:SEQ ID NO 10 ；第三外显子正向测序引物MICA-Seq-3-F,其序列为SEQID NO 11，反向测序引物 MICA-kq-3-R，其序列为:SEQ ID NO 12 ；第四外显子正向测序引物MICA-Seq-4-F，其序列为SEQ ID NO:13，反向测序引物 MICA-Seq-4-R，其序列为:SEQ ID NO :714 ；第五外显子反向测序引物MICA-Seq-5-R，其序列为SEQ ID NO:15，反向测序引物 MICA-kq-5-R，其序列为:SEQ ID NO 16 ；第六外显子正向测序引物MICA-Seq-6-F，其序列为SEQ ID NO:17。反向测序引物 MICA-kq-6-R，其序列为SEQ ID NO :18。8.权利要求7所述的方法，其特征在于所述测序反应体系为9.具有SEQID NO :1至SEQ ID NO :18任一项所示序列的核甘酸。10.一种用于权利要求1所述方法的试剂盒，包括SEQ ID NO :1和SEQ ID Ν0:2，和或 SEQ ID NO :3 禾口 SEQ ID NO :4，和或 SEQ ID NO :5 禾口 SEQ ID NO :6 的序列，以及一种或多种选自SEQ ID NO :7至SEQ ID NO 18的测序引物。全文摘要本专利技术涉及一种人类主要组织相容性复合体I类分子相关基因A基因测序分型方法及试剂盒，本专利技术的具体方法为提取样品基因组DNA；设计PCR引物对样品进行基因组DNA的PCR扩增；设计测序引物对所获得的PCR扩增产物进行双向测序，分别对其中第1、2、3、4、5、6外显子进行正、反向双向测序；根据测序结果进行分型。该方法可以解决目前MICA基因进口商品化测序试剂盒仅有单向测序试剂盒，避免单向测序碱基信号强度不一致及不能清晰反应突变存在的缺点，解决MICA模棱两可基因分型结果，获得第1和第6外显子碱基序列。文档编号C12N15/11GK102352409SQ20111028242公开日2012年2月15日 申请日期2011年9月21日 优先权日2011年9月21日专利技术者徐筱娉, 杨宝成, 邓志辉, 高素青 申请人:深圳市血液中心本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种人类主要组织相容性复合体Ｉ类分子相关基因Ａ基因测序分型的方法，其特征在于，所述测序为双向测序，并还可以包括第１和第６外显子的测序。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高素青，邓志辉，徐筱娉，杨宝成，
申请(专利权)人：深圳市血液中心，
类型：发明
国别省市：94
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