本发明专利技术一种寡核苷酸基因芯片及其在检测多种病菌方面的应用。所述寡核苷酸基因芯片的探针可分别与结核分枝杆菌（M．tuberculosis）、牛分枝杆菌（M.bovis）、鸟分枝杆菌（M.avium）、副结核分枝杆菌（M.paratuberculosis）和布氏杆菌（Brucella）的PCR扩增产物进行杂交反应；所述探针分别具有SEQIDNO：25、SEQIDNO：31、SEQIDNO：35、SEQIDNO：37和SEQIDNO：39所示的核苷酸序列。本发明专利技术所述基因芯片应用于检测所述病菌具有良好的重复性，批间批内变异系数CV值％均小于15％。对致病菌待测样本的检测表现出了高的准确度，表明该方法特异性良好，灵敏度高，实现了高通量、平行化检测，检测结果快速、准确，从核酸制备到完成检测，整个过程仅需6～8h，在制备病原检测、进出口检疫、流行病学分析用的试剂和产品等方面具有广阔的前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因芯片
，具体涉及一种寡核苷酸基因芯片及其在检测多种病菌方面的应用。
技术介绍
牛结核病(Bovis Tuberculosis)，是由牛分枝杆菌及结核分枝杆菌等菌引起的传染性疾病，该病不仅可以导致奶牛生产力下降，还是一种重要的人兽共患病，严重威胁着公共卫生安全。牛布病(Brucellosis)是由流产布氏杆菌等菌引起的传染性疾病，可以导致奶牛的流产，同时该菌也可以感染人，且难以治愈，今年来人感染布氏杆菌的病例呈上升趋势， 因此对于本病原菌的检测也具有重要的公共卫生学意义。目前关于结核病原菌的检测主要是通过结核菌素实验，但是受制于物理以及生物因素的影响，对本类病原菌的检出率不高；细菌分离培养是经典的鉴别手段，但是分枝杆菌生长周期长，一般要培养4 8周，不利于快速诊断；PCR方法的建立可以实现快速、灵敏的检测，但是易受到污染从而导致假阳性的结果。通过检测外周血淋巴细胞释放IFN-γ的水平也可以对分枝杆菌感染进行检测，且具有较高的敏感性和特异性，不足之处是成本太高， 且必须在采血后他内完成检测。对于布氏杆菌的检测，主要是采用试管凝集试验以及虎红平板凝集试验，该方法会受到物理或生物因素影响，导致假阳性或者假阴性结果。因此针对以上几种病原菌迫切需要研制出一种新型、快速、准确、高通量的检测技术，基因芯片方法以其特异性好，检测通量高而具有一定优势，目前利用基因芯片检测以上所述病原菌的相关技术亟待进一步研究。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是针对现有技术的不足，提供一种应用于检测多种病菌的寡核苷酸基因芯片，所述病菌包括结核分枝杆菌(i/· tokr^/Axsis)、牛分枝杆菌(I bovis)、 鸟分枝杆菌OK an·腫)、副结核分枝杆菌OK paratuberculosis)和布氏杆菌(^raceBa)寸。本专利技术的另一个目的是提供所述基因芯片在检测多种病菌方面的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现提供一种寡核苷酸芯片，包括基底和固定于该基底上的探针，所述探针可分别与结核分枝杆菌(i/· to力ercWosis)、牛分枝杆菌OK 力on、)、鸟分枝杆菌OK an'腫)、副结核分枝杆菌(M para tuberculosis )和布氏杆菌{Brucella )的PCR扩增产物进行杂交反应；所述五种细菌的基因序列的检索号分别为M. tuberculosis检索号为S69737. 1 ； M . bovis 检索号为BX248;341. 1 ；Μ. avium 检索号为NC_008595 ；Μ. paratuberculosis 检索号为S74401. 1 ；Brucella 检索号为NC_006933. 1。所述探针是以Genebank 上已公布的 i/· tuberculosis H37Rv、Μ. bovis ΑΝ5、M. avium、Μ. paratuberculosis和Brucella五种细菌的基因序列，分别选择M. tuberculosis H37Rv 的 mp t40 基因、I bo vis AN5 的 pncA 基因、a vian 的 gyrB 基因、 paratuberculosis的IS-900基因、Brucella的基因序列为参考序列,通过DNA star 软件分析比较，设计出多组引物，进行比较分析，针对每种细菌确定了一对特异性引物；克隆鉴定上述5种菌株的阳性质粒，构建质粒参比品；针对上述菌株基因片段设计了 15条相应的寡核苷酸探针进行特异性的筛选检测，最终筛选出5条灵敏度高、特异性强的探针。所述引物分别具有SEQID NO :3和SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO :9和SEQ ID NO 10 ； SEQ ID NO: 11 禾口 SEQ ID NO 12 ；SEQ ID NO: 17 禾口 SEQ ID NO 18 ；SEQ ID N0:23 禾口 SEQ ID NO : 所示的核苷酸序列；所述探针分别具有 SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 31、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO :39所示的核苷酸序列。引物的核苷酸序列表示如下菌株名称引物名称引物序列.,DC* ISC A A C G GC TO GCTC A AG IC:T〔. Q Q1-T^ YQ Q Q JYJ-r-Q Q:d-丄 Ct-iT^i CZ Cl-丄 CL Cl! 二 C.-ι. CL α 丄 d- CZ C.- Cl j.:B￥3 CC:C:TGIC-CCGGAG AAC-CCC-探针序列信息如下ACCGCACCIICCACTACCC C-C:C-ACC-A.4ACCC-CCIieiACICGACCGCIAATIGAC-cagcgcgc-ccicgic:gii产物长度3F CAACC-C-CTCAGATCAAGGTCAAI BR2 AeCGCAieCGAC-AIGGACeAAJiC - “·探针名称探针序列(5’-3’ )长度(bp)ptlACGGGTGGCTCAAGTTGGGTCTGGT-NH2-25pb3CGGCGTCATGGACCCTATATCTG-NH2-23A3TCGAGGGCCAGACCAAGACCAAAC-NH2-24P2GGCGTGGTCGTCTGCTGGGTTGATC-NH2-25B2MCATTGACCGCATTCATGGGTTTCG-NH2-26在上述序列基础上，本领域技术人员可以通过常规方法进行引物和探针的合成。所有下游引物在合成中用生物素基团亚磷酰化试剂在5’端进行Cy3标记。寡核苷酸探针在3’ 端进行氨基修饰，氨基基团与探针序列之间以间隔臂(聚乙二醇磷酰化试剂)相连，增加探针的活性动力并提高杂交荧光信号的强度。本专利技术同时提供了所述基因芯片在检测多种病菌方面的应用，筛选特异性探针，将所筛选出的特异探针点样至基片上，与待测病菌菌株PCR扩增产物进行杂交反应，洗涤干燥后经扫描仪扫描获取杂交信号，实现检测目的。 具体地，包括以下步骤(1)应用权利要求1所述的引物和探针，将探针点样至基因基片上；(2)基因基片上的探针与待测病菌菌株的PCR扩增产物进行杂交反应；4(3)杂交反应后，洗涤干燥，经扫描仪扫描获取杂交信号。步骤(2)所述PCR扩增为五重PCR不对称反应体系，扩增条件为所述结核分枝杆菌(M. tuberculosis )、牛分枝杆菌(I bo vis )、鸟分枝杆菌(I a vium )、副结核分枝杆菌(M para tuberculosis )和布氏杆菌(^Brucella )引物的荧光引物与非荧光引物的最适浓度比例分别为10 :1、8 1,10 1,10 1,10 1 ；终浓度分别为 1. ΟμΜ/Ο. μΜ、1. ΟμΜ/Ο. 125μΜ、0. 75μΜ/0. 075μΜ、2. 0μΜ/0. 2μΜ、1. 0μΜ/0. μΜ ；DNA聚合酶的用量为1. OU ；Mg2+浓度为3. OmM/L ；PCR退火温度56°C。步骤(2)所述杂交反应的条件为杂交温度为42°C，杂交时间为60min。本专利技术的有益效果是本专利技术可以实现对不同病原菌的快速，高通量检测，且具有较好的敏感性特异性，可以满足对本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种应用于检测样本中多种病菌的寡核苷酸芯片，包括基底和固定于该基底上的探针，其特征在于所述探针可分别与结核分枝杆菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、牛分枝杆菌（Ｍ． ｂｏｖｉｓ）、鸟分枝杆菌（Ｍ． ａｖｉｕｍ）、副结核分枝杆菌（Ｍ． ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）和布氏杆菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）的ＰＣＲ扩增产物进行杂交反应；所述探针是以Ｇｅｎｅｂａｎｋ上已公布的Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ、Ｍ． ｂｏｖｉｓ ＡＮ５、Ｍ． ａｖｉｕｍ、Ｍ． ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ和Ｂｒｕｃｅｌｌａ五种细菌的基因序列，分别选择Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ的ｍｐｔ４０基因、Ｍ． ｂｏｖｉｓ ＡＮ５的ｐｎｃＡ基因、Ｍ． ａｖｉａｎ的ｇｙｒＢ基因、Ｍ． ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ的ＩＳ－９００基因、Ｂｒｕｃｅｌｌａ的Ａｌｋｂ基因序列为参考序列，设计引物，筛选得到；所述引物分别具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４所示的核苷酸序列；所述探针分别具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１ 、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９所示的核苷酸序列；上述引物中所有下游引物在５’端进行Ｃｙ３标记；所述探针在３’端进行氨基修饰。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李守军，贾坤，林志雄，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81
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