基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于三通连接‑核酸分子线路换能器的分子检测方法，属于基因检测技术领域。本发明专利技术是针对单元或多元核酸检测时需要完全按照不同的目标待测核酸去重新设计引物的序列而提出的方法，包括以下步骤：步骤(1)：由目标核苷酸和传导探针制备分子引发剂；步骤(2)：将核酸分子线路各组分分别进行退火处理；步骤(3)：将分子引发剂、核酸分子线路各组分混合加热；步骤(4)：检测荧光信号，获得荧光检测曲线。本发明专利技术的方法，灵敏度高、特异性好，不同的目标待测核酸可以共用同一套核酸分子线路，实现只用一套核酸分子线路，一种信号探针去检测不同目标基因的目的，最大程度的降低了设计风险和成本，可用于单元或者多元核酸的检测。

Molecular detection method based on three way connection nucleic acid molecular circuit transducer

The invention discloses a molecular detection method based on a three way connection nucleic acid molecular circuit transducer, which belongs to the field of gene detection technology. The present invention is a method proposed in order to redesign the sequence of primers according to the different targets to be tested for nucleic acid to redesign primers in accordance with the different targets. Steps (1): the preparation of molecular initiators by the target nucleotides and the conduction probe; step (2): each component of the nucleic acid molecule line is carried out in the annealing place, respectively Principle (step 3): the mixture of molecular initiator and nucleic acid molecule is mixed and heated; step (4): fluorescence signal is detected and fluorescence detection curve is obtained. The method of the invention has high sensitivity and specificity, and different target nucleic acid can share the same set of nucleic acid molecular lines, realizing only one set of nucleic acid molecular lines, a signal probe to detect different target genes, and to minimize design risk and cost, and can be used in unit or multiple nucleic acid. Test.

【技术实现步骤摘要】
基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法
本专利技术涉及核酸分子检测
，尤其涉及一种基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法。
技术介绍
基因是指携带有遗传信息的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)碱基排列(序列)。从现代医学的角度出发，除外伤外，几乎所有的疾病都和基因有关系。因此，精准检测到基因序列信息，就意味着获取了任何生物类病原的最直接标签。人们对这一理念的高度认可刺激了上个世纪后期以来基因测序和基因诊断学的蓬勃发展和广泛应用。其中，基因诊断学是除了基因测序以外的所有基因检测方法的统称。目前，医疗、检验检疫等单位使用最为广泛的基因诊断法是专利技术于1983年的热循环聚合酶链扩增反应(PCR)，但是PCR反应不能实现实时检测，为了更进一步的实现实验的可能性和最终实现现场即时检测(POCT)，一系列的超灵敏等温放大技术得到发展，如用核酸序列为基础的扩增核酸依赖性扩增检测技术(NASBA)、滚环扩增(RCA)、解链酶扩增(HAD)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和环介导等温扩增技术(LAMP)等。其中，LAMP是一个极有效的等温核酸放大技术，它能在一个小时内将很少的目标基因片段放大到109倍，但是与此同时也会出现大量的非目标DNA，因此检测它的目标产物变的十分困难。面对以上症结，国内外先驱已基于前人建立的信号传导原理陆续提出“探针吸附法”、“探针累积法”和“序列特异识别法”三种解决办法。在前两种方法中，非目标产物通过自组装并不会被表现出来，例如在聚合过程中产生的焦磷酸离子，形成白色沉淀的焦磷酸盐，所以这些扩增产物可以被肉眼识别。另外，可以通过将染料钙黄绿素和羟基萘酚蓝扦插到核酸碱基对中来进行实时荧光检测。这种检测方法的弊端是由于随机的扦插产生假阳性信号。前两中方法的信号分别来源于扩增产物对小分子电化学探针(如亚甲基蓝和二茂铁等)产生的非特异性吸附和链增长累积，虽然足够灵敏，但这两种方法都只是识别核酸碱基对数目，而不是碱基排序，因此无法有效区分正确的扩增产物和非特异性的错误扩增副产物，频发假阳性误诊。相比之下，“序列特异识别法”由于依赖扩增产物与其互补序列进行杂交，因此特异性高的多，基本可以排除假阳性误诊。为了提高检测的选择性，特异性的检测方法后续也有类似的方法，如PCR中加入Taqman探针，近期也延伸到等温扩增技术中，尤其是环介导等温扩增技术。为了获得最高的杂交效率，序列特异性识别法的最佳检测对象是如环介导等温扩增技术等能生成单链环产物的反应。在所有的等温扩增中，环介导等温扩增技术是尤其的特异，因为它可以只利用一个聚合酶去扩增RNA或DNA模板达到109倍。通过交替延展和链置换反应，最终扩增出包含四种单链环序列的长茎环多联体。这些非杂交的环，通常15到35个碱基，可以作为下游序列特异性的信号探针输入口。而“序列特异识别法”的缺点是信号噪音偏高、单点突变分辨率差，当正确扩增产物被错误副产物稀释时，更会因检不出而频发假阴性误诊，且针对不同的待测物需重新设计探针序列，繁琐且增加检测成本和时间。一步链置换(OSD)方法相比杂交法更加具有特异性，而且更简单。在典型的OSD反应中(如图1)，目标基因通常被叫做引发剂，被划分为两个单链的区域片段。短片段(域α，通常少于12个碱基)做为立足点(TH)去绑定探针的互补粘性末端。随后，较长的片段叫做分支迁移域(BM，域2-3，通常多于16个碱基)触发一个分支迁移过程，最终取代探针中的阻滞链(域2-3)使其从荧光探针混合物中脱离。通常情况下，FAM染料和淬光剂被标记在受体探针和阻滞链上。分解淬光剂后可以使荧光恢复从而观测OSD过程。除了直接检测，更多的OSD过程可以串联，形成不同类型的多步检测被叫为无酶核酸分子线路。为了增大反应的敏感度和信号幅度，将OSD反应从一步法到多步法，形成一个无酶分子线路，被称之为双发卡催化自组装(CHA)反应。双发卡催化自组装(CHA)是具有放大功能的分子线路之一。在一个典型的CHA反应中(如图2)，引发剂(通常叫做C1)发生第一个OSD反应打开一个H1链的发夹结构。因此，域3在H1链中做为立足点释放和另一个发卡结构H2链发生第二个OSD反应，形成一个C1:H1:H2的中间体。因为C1与H1仅仅通过α-α*相互结合作用，所以C1会自动的分离出来，剩下H1:H2的混合物做为最终产物。分离出的C1可以继续使用不需要消耗，就像一个催化剂。为了监测CHA反应，H1:H2可以设计成为触发另外一个OSD反应，置换一个被淬光剂标记的链(简称Q)脱离出FAM标记的链(简称F)。然而，所有这些反应都需要完全按照不同的LAMP扩增产物去重新设计下游OSD和CHA组分或探针的序列，不但价格昂贵、设计复杂，而且存在较高的设计失败的风险，尤其是针对多元分析。
技术实现思路
本专利技术提出了一种基于三通连接-核酸分子线路换能器的多元分子检测方法，即在待测核酸发生等温扩增反应(LAMP)的过程之中或之后，加入一条传导探针，与扩增产物中的一段核苷酸序列杂交形成引发剂，该引发剂会以形成三通核酸连接结构的方式引发下游的核酸分子线路(如OSD或CHA)，产生可以被检测到的荧光信号。这一专利技术的目的是在增加等温扩增的信号幅度和精准度的同时，提高单碱基突变检测的分辨率，且无需再根据不同的扩增产物设计特定的核酸分子线路探针(如CHA中的H2与荧光探针)，即针对不同扩增产物的检测，只需要改变核酸分子线路CHA组分中H1的α*域，无需改变H1的其他序列，并完全共享同样的H2序列和荧光探针。该方法在检测核酸分子时具有极高的普适性和可控性，检测更便捷，结果更可靠，可以实现单元分析、多元分析和半定量分析。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法，在一步链置换核酸分子线路法检测中，所述方法包括以下步骤：(1)：由目标核苷酸和传导探针制备分子引发剂；(2)：将核酸分子线路的各组分分别进行退火处理；所述核酸分子线路为OSD核酸分子线路，其组分包括受体探针、OSD-F探针和OSD-Q探针；(3)：将分子引发剂和核酸分子线路的各组分混合加热；(4)：检测荧光信号，获得荧光检测曲线；所述目标核苷酸为核酸等温扩增产物中的特定线性单链或环型单链核苷酸，包含α域和β域；所述传导探针为单链核苷酸，包含与β域碱基互补的可变域β*域和固定域2-3域；所述受体探针包含与目标核苷酸的α域碱基互补的可变域α*域、与传导探针的固定域2-3域碱基互补的固定域2*-3*域和固定域4*域；所述OSD-F探针依次包括与受体探针固定域2*-3*域碱基互补的固定域2-3域和3’端FAM；所述OSD-Q探针依次包括与受体探针固定域4*域碱基互补的固定域4域和5’端BHQ1。进一步地，在一步链置换(OSD)核酸分子线路法检测中，若检测目标核苷酸为一种，检测流程为终点检测，所述方法包括以下步骤：(1)将目标核苷酸和传导探针混合在1×TNak缓冲液中，在95℃下退火5min，0.1℃/s下缓慢降到室温，形成分子引发剂；(2)将受体探针、OSD-F探针和OSD-Q探针混合在1×TNak缓冲液中，并加入终浓度为2μM的(dT)21，在95℃下退火5min，然后在0.1℃/s下缓慢降到室温；本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于三通连接‑核酸分子线路换能器的分子检测方法，其特征在于，在一步链置换核酸分子线路法检测中，所述方法包括以下步骤：(1)：由目标核苷酸和传导探针制备分子引发剂；(2)：将核酸分子线路的各组分分别进行退火处理；所述核酸分子线路为OSD核酸分子线路，其组分包括受体探针、OSD‑F探针和OSD‑Q探针；(3)：将分子引发剂和核酸分子线路的各组分混合加热；(4)：检测荧光信号，获得荧光检测曲线；所述目标核苷酸为核酸等温扩增产物中的特定线性单链或环型单链核苷酸，包含α域和β域；所述传导探针为单链核苷酸，包含与β域碱基互补的可变域β*域和固定域2‑3域；所述受体探针包含与目标核苷酸的α域碱基互补的可变域α*域、与传导探针的固定域2‑3域碱基互补的固定域2*‑3*域和固定域4*域；所述OSD‑F探针依次包括与受体探针固定域2*‑3*域碱基互补的固定域2‑3域和3’端FAM；所述OSD‑Q探针依次包括与受体探针固定域4*域碱基互补的固定域4域和5’端BHQ1。

【技术特征摘要】
1.基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法，其特征在于，在一步链置换核酸分子线路法检测中，所述方法包括以下步骤：(1)：由目标核苷酸和传导探针制备分子引发剂；(2)：将核酸分子线路的各组分分别进行退火处理；所述核酸分子线路为OSD核酸分子线路，其组分包括受体探针、OSD-F探针和OSD-Q探针；(3)：将分子引发剂和核酸分子线路的各组分混合加热；(4)：检测荧光信号，获得荧光检测曲线；所述目标核苷酸为核酸等温扩增产物中的特定线性单链或环型单链核苷酸，包含α域和β域；所述传导探针为单链核苷酸，包含与β域碱基互补的可变域β*域和固定域2-3域；所述受体探针包含与目标核苷酸的α域碱基互补的可变域α*域、与传导探针的固定域2-3域碱基互补的固定域2*-3*域和固定域4*域；所述OSD-F探针依次包括与受体探针固定域2*-3*域碱基互补的固定域2-3域和3’端FAM；所述OSD-Q探针依次包括与受体探针固定域4*域碱基互补的固定域4域和5’端BHQ1。2.根据权利要求1所述的基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法，其特征在于，在一步链置换核酸分子线路法检测中，若检测目标核苷酸为一种，检测流程为终点检测，所述方法包括以下步骤：(1)将目标核苷酸和传导探针混合在1×TNak缓冲液中，在95℃下退火5min，0.1℃/s下缓慢降到室温，形成分子引发剂；(2)将受体探针、OSD-F探针和OSD-Q探针混合在1×TNak缓冲液中，并加入终浓度为2μM的(dT)21，在95℃下退火5min，然后在0.1℃/s下缓慢降到室温；(3)将分子引发剂、受体探针、OSD-F探针和OSD-Q探针等体积混合，加热到25～65℃保持2～3小时；(4)检测荧光信号，每2分钟采一点，获得荧光检测曲线。3.根据权利要求1所述的基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法，其特征在于，在一步链置换核酸分子线路法检测中，若检测目标核苷酸为一种，检测流程为实时检测，所述方法包括以下步骤：(1)制备目标核苷酸的等温扩增引物混合液；(2)将受体探针、OSD-F探针和OSD-Q探针混合在1×TNak缓冲液中，在95℃下退火5min，然后在0.1℃/s下缓慢降到室温；(3)将受体探针、OSD-F探针和OSD-Q探针等体积混合在1×TNak缓冲液中，并加入传导探针与目标核苷酸的等温扩增引物混合液，再加入Bst2.0聚合酶，25℃-65℃保持4～5小时；(4)检测荧光信号，每2分钟采一点，获得荧光检测曲线。4.基于三通连接-核酸分子线路换能器的分子检测方法，其特征在于，在双发卡催化自组装多步核酸分子线路法检测中，所述方法包括以下步骤：(1)：由目标核苷酸和传导探针制备分子引发剂；(2)：将核酸分子线路各组分分别进行退火处理；所述核酸分子线路为CHA核酸分子线路，其组分包括H1、H2、CHA-F探针和CHA-Q探针；(3)：将分子引发剂和核酸分子线路各组分混合加热；(4)：检测荧光信号，获得荧光检测曲线；所述目标核苷酸为核酸等温扩增产物中的特定线性单链或环型单链核苷酸，包含α域和β域；所述传导探针为单链核苷酸，包含与β域碱基互补的可变域β*域和固定域2-3域；所述H1依次包含与目标序列可变域α域碱基互补的可变域α*域、发卡结构固定域2*-3*-4-3-2和固定域5-6，其中2*-3*和3-2为碱基互补区域；所述H2依次包含与H1碱基固定域碱基互补的固定域3*和发卡结构固定域4*-3-2-4域，其中4和4*为碱基互补区域；所述CHA-F探针依次包括5’端FAM、与H1固定域5-6碱基互补的固定域6*-5*；所述CHA-Q探针依次包括与H1固定域2碱基互补的固定域2*、与CHA-F探针固定域5*-6*域互补的5-6域和3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：李冰凌，吕佰阳，唐艺丹，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：吉林,22