志贺氏菌干粉化LAMP快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了志贺氏菌干粉化LAMP快速检测试剂盒，该试剂盒由干粉化检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、封闭液、显色液和裂解液组成，以上7种试剂分别置于容器中。应用于本试剂盒中的6条引物对应志贺氏菌特异性靶基因序列的8个区段，通过加入显色液，阴阳性显色差异明显，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合于食品安全卫生领域中的志贺氏菌快速检测。另外，本发明专利技术为干粉化的检测试剂，便于常温运输，且使用简单、快捷，无需专门仪器，降低成本并拓宽产品应用范围，更适用于现场及偏远地区基层对志贺氏菌的快速检测，具有广泛的应用前景。

Rapid detection kit for dry powder LAMP detection of Shigella

The present invention discloses a rapid detection kit for Shigella dry powder LAMP. The kit consists of dry powder detection reagent, complex solution, positive control dry powder, negative control dry powder, sealing solution, color solution and lysate, and the above 7 reagents are respectively placed in the container. The 6 primers used in this kit correspond to the 8 sections of the specific target gene sequence of Shigella. By adding color solution, the color difference between yin and Yang is obvious. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, easy operation and simple results. It is suitable for rapid detection of Shigella in food safety and health field. In addition, the invention is a testing reagent for dry powder, easy to transport at normal temperature, easy to use, quick, without special instruments, lower cost and widen the application range of products. It is more suitable for rapid detection of Shigella at the base of field and remote areas, and has wide application foreground.

【技术实现步骤摘要】
志贺氏菌干粉化LAMP快速检测试剂盒
本专利技术涉及微生物分子生物学检测试剂，具体涉及一种基于LAMP技术的干粉化志贺氏菌核酸快速检测试剂盒.
技术介绍
志贺氏菌属(Shigella)即通称的痢疾杆菌，是一类革兰氏阴性杆菌，属于肠杆菌科，根据其抗原构造的不同分为四个种，分别为痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)、福氏志贺氏菌(S.flexneri)、鲍氏志贺氏菌(S.boydii)、宋内志贺氏菌(S.sonnei)。志贺氏菌属的四个种均是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌属，在人体中产生溃疡性结肠感染。该病原菌一般通过排泄物污染的食物或水传播的。每年全球可见大量因志贺氏菌感染肠道疾病的报道，夏秋两季患者最多，我国也深受其害，因此在食品安全领域如何快速准确对志贺氏菌进行快速的鉴定具有重要的意义。目前对致病微生物的检测有多种方法，传统方法以病原微生物分离培养鉴定、形态学鉴定和生化鉴定为主。目前志贺氏菌的检测以选择性培养基为主，其原理是利用志贺氏菌不利用乳糖、蔗糖等糖类物质产酸的特性而与其它肠杆菌相区别。显色培养基方面，目前暂未发现志贺氏菌表达的特异性酶，使得志贺氏菌的显色培养基开发受到了限制。因此目前志贺氏菌显色培养基大多利用特异性酶使其它细菌显色，从而与不显色的志贺氏菌相区分。但是由于志贺氏菌的生物学特性与肠杆菌科其它细菌如大肠杆菌、沙门氏菌等非常相似，从而导致大量假阳性和假阴性结果。近年来免疫学检测、以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的生物学检测方法相继应用于微生物检测，这些技术突破了传统的微生物学检测模式，无需繁琐的培养和分离提纯过程，而直接对样品或者样品增菌液中的致病菌进行分离和快速核酸抽提，结合分子生物学技术进行快速检测，辅以生物信息等手段进行分析，具有快速准确、灵敏度高、特异性强的特点。另一方面，这些方法也有其天然的缺陷，普通的PCR检测需要专门的仪器，检测过程相对繁琐，样品容易污染出现假阳性的情况，这使得其应用受到了限制。Real-timePCR需要更为昂贵的检测仪器，并且成本比较高。免疫学的检测方法依赖高质量的单克隆抗体，否则无法提供准确的结果。LAMP技术是在2000年由日本研究人员Notomi等人开发的一种新型的核酸体外恒温扩增特异片段的分子检测技术。该技术利用2对特殊引物和具有链置换活性的BstDNA聚合酶。使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在恒温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应，与常规PCR相比，无需反复变温、电泳判读等过程，在灵敏度、特异性和检测范围等技术指标上能媲美甚至高于PCR技术，而不依赖专门的仪器可以实现现场的快速检测，其成本远低于荧光定量PCR。而在实际的应用中，如果在非实验室的条件下利用LAMP技术进行快速检测，检测前都要配制相应的反应体系溶液，容易导致由于多次操作引起的误差，且易造成实验区间的交叉污染，检测所需的部分试剂需要冷冻储存，不适合高温长途运输，尤其是BstDNA聚合酶，需要在-20℃条件下保存，不宜反复冻融，以免影响酶活，因此会增加试剂的运输成本。目前该检测方法尚未在食品安全、医药等领域推广开来，且作为非标方法，目前已有的LAMP产品仅仅针对检测流程，涉及到样品前处理的方式均无提及，加之市场上基于LAMP技术的志贺氏菌快速诊断试剂盒较少，且能用于常温运输的干粉型同类产品尚未出现。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有志贺氏菌的传统致病微生物检测技术以及其相关产品制备工艺的不足，提供一种基于LAMP技术可常温运输的干粉化志贺氏菌快速诊断试剂盒以及其制备使用方法。该试剂盒和使用方法涵盖从取样到检测的整体解决方案，可满足相关食品的生产、流通中各个环节的快速检测的需求。本专利技术所采取的技术方案是：一种志贺氏菌的LAMP引物组，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其序列如下：志贺氏菌-F3：agcagacgaaatgtggcac志贺氏菌-B3：tcgctagtgacagtgatgta志贺氏菌-FIP：cgatgcgtagggacgcaggtagcatctgggagcattggtacg志贺氏菌-BIP：agtgcgcagagttagcccagctgacttgtggctgacgccag志贺氏菌-LF：cgcacaggcaggcctgcctgacg志贺氏菌-LB：gccgtggccattagtgtgcctg。一种志贺氏菌的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其LAMP引物组如上所示。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，检测试剂盒包括干粉化的检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色液、裂解液和封闭液。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，干粉化的检测试剂冻干前含有0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白的冻干复合保护剂，余量为无菌超纯水。冻干复合保护剂优选含3％～5％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白。特别的，冻干复合保护剂为：3％海藻糖(w/v)、0.01％甘氨酸(w/v)、0.1％牛血清白蛋白。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，复溶液含有2～9mmol/LMgSO4、8～12mmol/LKCl、15～20mmol/LTris-HCl、8～12mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.3％TritonX-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，显色液由0.3～1.5mmol/L的钙黄绿素和2.4～7.2mmol/L的MnCl2按照混合得到，钙黄绿素的终浓度为15～75μmol/L，MnCl2的终浓度为120～360μmol/L。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，裂解液含有：10～20mmol/LTris-HClpH8.3、1mmol/LEDTA、0.3～1％SDS。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，封闭液为无菌石蜡油。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，阳性对照干粉为提纯的志贺氏菌基因组DNA冻干粉，阴性对照干粉为提纯的非志贺氏菌基因组DNA冻干粉。作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，使用方法包括如下步骤：(1)参照GB/T4789.5-2016《食品微生物学检验志贺氏菌检验》，取25g待检食品样品置于225mL志贺氏菌增菌肉汤中进行增菌10h±2h，对增菌液中的菌体富集用于LAMP快速检测；(2)增菌液6000r/min离心，去上清；(3)分别向(2)中离心得到沉淀中加入裂解液，充分悬浮，水浴或者金属浴99℃热裂解10min，裂解结束后12000r/min离心15min，上清即为待检样品粗提核酸；(4)取n个冻干粉管(n＝待检测样品数+1管阳性对照+1管阴性对照)，向冻干粉管内加入复溶液，待冻干粉充分溶解后，将待检测的样品核酸加入反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种志贺氏菌的LAMP引物组，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其特征在于：其序列如下：志贺氏菌‑F3：agcagacgaaatgtggcac志贺氏菌‑B3：tcgctagtgacagtgatgta志贺氏菌‑FIP：cgatgcgtagggacgcaggtagcatctgggagcattggtacg志贺氏菌‑BIP：agtgcgcagagttagcccagctgacttgtggctgacgccag志贺氏菌‑LF：cgcacaggcaggcctgcctgacg志贺氏菌‑LB：gccgtggccattagtgtgcctg。

【技术特征摘要】
1.一种志贺氏菌的LAMP引物组，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其特征在于：其序列如下：志贺氏菌-F3：agcagacgaaatgtggcac志贺氏菌-B3：tcgctagtgacagtgatgta志贺氏菌-FIP：cgatgcgtagggacgcaggtagcatctgggagcattggtacg志贺氏菌-BIP：agtgcgcagagttagcccagctgacttgtggctgacgccag志贺氏菌-LF：cgcacaggcaggcctgcctgacg志贺氏菌-LB：gccgtggccattagtgtgcctg。2.一种志贺氏菌的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：其LAMP引物组如权利要求1所示。3.根据权利要求1所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：检测试剂盒包括干粉化的检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色液、裂解液和封闭液。4.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：干粉化的检测试剂冻干前含有0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白的冻干复合保护剂，余量为无菌超纯水。5.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：复溶液含有2～9mmol/LMgSO4、8～12mmol/LKCl、15～20mmol/LTris-HCl、8～12mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.3％TritonX-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。6.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：显色液由...

【专利技术属性】
技术研发人员：万强，吴清平，周杨，卢勉飞，曲晓莹，容艳芬，蔡芷荷，
申请(专利权)人：广东环凯微生物科技有限公司，广东粤微食用菌技术有限公司，广东环凯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44