对虾急性肝胰腺坏死病（AHPND）的RAA恒温荧光检测方法及试剂技术

本发明专利技术公开了一种对虾急性肝胰腺坏死病（AHPND）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、重组聚合酶和对照品。本发明专利技术的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到2fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

RAA isothermal fluorescence detection method and reagent for acute hepatopancreas necrosis (AHPND) of shrimp

The invention discloses a RAA constant temperature fluorescence detection method and a detection kit for shrimp acute hepatopancreas necrosis (AHPND). The detection kit includes a positive primer SEQ ID NO.1, a reverse primer SEQ ID NO.2, a specific fluorescent probe SEQ ID NO.3, a reaction liquid, a recombinant polymerase and a control product. The kit has strong specificity, high detection sensitivity, can reach 2fg/ mu L, high accuracy, reliable, simple and quick operation, suitable for field detection, and has extensive application scene.

【技术实现步骤摘要】
对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的RAA恒温荧光检测方法及试剂
本专利技术属于分子生物学
，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种对虾肝肠胞虫的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。
技术介绍
对虾急性肝胰腺坏死病(Acutehepatopancreaticnecrosisdisease，AHPND)是在我国华南沿海南美白对虾养殖中突发一种被称为“偷死病”的疾病，该病一般在投苗20至30天后发生，病虾体色呈白浊并微红，昏睡、厌食、生长缓慢，疾病能扩散迅速，造成仔虾和幼虾阶段大量死亡，死亡对虾的肝胰腺呈现不同程度的缩小、褪色和坏死等病变特征(Lightneretal.,2012)。随后在越南(2010)、马来西亚(2011)和泰国(2012)等亚太地区相继报道了此疾病(Panakorn,2012；Flegel,2012；Mooney,2012)，目前已蔓延至拉丁美洲等多个对虾养殖国家和地区，无论是大型水产养殖公司，还是小型私人养殖户都遭受到了不同程度的经济损失，给全球的对虾养殖产业造成了新一轮的巨大冲击。对虾AHPND的病原目前已被证实为一种特殊的副溶血弧菌，该弧菌携带一个约70kb的质粒pVA1，编码致死性毒素蛋白PirA和PirB，从而变成有毒菌株(Leeetal.,2015,PNAS)。为了降低对虾AHPND的爆发给对虾养殖业带来损失，建立可靠、快速的针对这株特异性副溶血性弧菌的检测方法至关重要。为此，泰国T.W.Flegel教授以及中国台湾罗竹芳教授为首的研究人员已经建立了基于普通PCR技术的检测方法。由于检测靶位点是针对70kb质粒pVA1的其它基因，而非PirA和PirB毒力蛋白，该PCR方法会造成假阳性检测结果；因为一些副溶血弧菌菌株携带pVA1质粒，但自然缺少PirA和PirB毒力蛋白。另外，PCR检测方法需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于对虾现场普及推广使用。重组酶介导扩增(Recombinase-aidAmplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。为实现以上目的，本专利技术采用以下技术方案：一种对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)核酸的检测试剂盒，包括：对虾急性肝胰腺坏死病正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述对虾急性肝胰腺坏死病正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述对虾急性肝胰腺坏死病反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、对虾急性肝胰腺坏死病标准品和ddH2O中至少一种。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20％PEG；BBuffer为280mMMgAc。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μLSSB蛋白、120ng/μLrecA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μLRad51、30ng/μLBsuDNA聚合酶，100mmol/LTricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，对虾急性肝胰腺坏死病标准品为含有对虾急性肝胰腺坏死病PirB基因部分序列的阳性质粒。在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述含有对虾急性肝胰腺坏死病PirB基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种对虾急性肝胰腺坏死病的RAA恒温荧光检测方法，提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA为模板，在对虾急性肝胰腺坏死病的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、ABuffer、BBuffer和ddH2O存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述对虾急性肝胰腺坏死病正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述对虾急性肝胰腺坏死病反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中的应用，还包括以下的步骤：(1)、弧菌菌株的纯化分离：从待检对虾组织中使用无菌接种环取样划线于TCBS平板上进行过夜培养，纯化分离弧菌菌株；(2)、弧菌DNA溶液的制备：：在离心管中加入50μL无菌TE溶液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)，挑取弧菌单菌落至上述TE溶液中，将离心管放置在涡旋混合器上充分震荡10s，沸水煮10min，冷却至室温，再充分震荡10s后12000r/min离心2min，上清液即为弧菌DNA，置于-20℃备用；在一些实施方案中，所述实施荧光RAA反应程序为：37℃，40s；37℃，20min，共计40个循环；本专利技术所述检测方法需要实时荧光RAA反应结束后，利用实时荧光RAA仪分析软件，根据实时荧光RAA的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为待测样本FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为对虾急性肝胰腺坏死病阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为对虾急性肝胰腺坏死病阴性结果。有益效果1、快速高效：整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到109-1010个拷贝；2、操作简单：不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变形等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件比较温和；3、高特异性：本专利技术对对虾其他的病症对虾传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)、对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)、对虾白斑综合症病毒(WSSV)、对虾桃拉综合症病毒(TSV)的DNA均不发生扩增。4、高灵敏度：本专利技术的检测极限可以达到2fg/反应5、鉴定简单：根据实时荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对虾急性肝胰腺坏死病（AHPND）核酸的检测试剂盒，包括：对虾急性肝胰腺坏死病正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述对虾急性肝胰腺坏死病正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述对虾急性肝胰腺坏死病反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种对虾急性肝胰腺坏死病（AHPND）核酸的检测试剂盒，包括：对虾急性肝胰腺坏死病正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述对虾急性肝胰腺坏死病正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述对虾急性肝胰腺坏死病反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。3.根据权利要求1和2所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、对虾急性肝胰腺坏死病标准品和ddH2O中至少一种。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20%PEG；BBuffer为280mMMgAc。5.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μLSSB蛋白、120ng/μLrecA重组酶蛋白（SC-recA/BS-recA）或30ng/μLRad51、30ng/μLBsuDNA聚合酶，100mmol/LTricine、20%PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。...

【专利技术属性】
技术研发人员：程奇，钱冬，黄震巨，张建勋，肖文，余国君，陶智勇，徐锦余，霍胜楠，沈弘，郑晓叶，郑天伦，沈伟良，吕文浩，
申请(专利权)人：杭州众测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33