虾肝肠胞虫（EHP）的RAA恒温荧光检测方法及试剂技术

本发明专利技术公开了一种对虾肝肠胞虫（EHP）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、重组聚合酶和对照品。本发明专利技术的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到100fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

RAA constant temperature fluorescence detection method and reagent for shrimp liver and intestinal worm (EHP)

The invention discloses a constant temperature fluorescent detection method and a detection kit for RAA of shrimp liver and intestinal worm (EHP). The detection kit includes a positive primer SEQ ID NO.1, a reverse primer SEQ ID NO.2, a specific fluorescent probe SEQ ID NO.3, a reaction liquid, a recombinant polymerase and a control product. The kit has strong specificity, high detection sensitivity, can reach 100fg/ mu L, high accuracy, reliable, simple and quick operation, suitable for field detection, and has extensive application scene.

【技术实现步骤摘要】
虾肝肠胞虫(EHP)的RAA恒温荧光检测方法及试剂
本专利技术属于分子生物学
，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种对虾肝肠胞虫的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。
技术介绍
虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)又称肠胞虫，是近年来发现与对虾中的微孢子虫，主要感染染凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、斑节对虾(Penaeusmonodon)等重要养殖虾类，2009年于泰国养殖池塘生长迟缓的斑节对虾中发现。有报道EHP在泰国和越南出现白便综合征(whitefaecessyndrome，WFS)的斑节对虾和凡纳滨对虾中有较高的检出率，且严重感染虾肝肠胞虫。感染肠胞虫的虾可以发现生长缓慢，严重影响了对虾的养殖生产周期。而对虾中的微孢子虫一旦混入水产食品，将会影响人体的健康。迄今仍然没有能有效控制肠胞虫疫情的技术措施，国内外学者普遍认为，综合预防是相对有效的方法，即尽早发现疾病并采取诸多措施阻止病毒传播。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的EHP病原检测方法是减少虾肝肠胞虫发生和危害的重要途径。泰国学者(Amornratetal，2013；Suebsingetal，2013；Tourtipetal，2009)已经报道了PCR法、地高辛标记核酸探针原位杂交法以及LAMP检测方法检测寄生于斑节对虾和凡纳滨对虾肝胰腺中的EHP。目前检测方法正向更特异、更快速、更便捷、更安全、集成化、微量化、定量化、费用低廉化的方向发展，但这种方法耗时、特异性和灵敏度低，远不能满足日常快速检测工作的需要。自问世以来，PCR技术凭借灵敏、特异、快速等优点，被普遍应用于水产养殖病原的检测中。但PCR技术对实验环境和操作要求苛刻，产物容易污染，导致假阳性。与一般PCR技术相比，荧光PCR检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR耗时长，成本较高，目前在水产养殖动物的常规病原体检测中的应用还不多。LAMP等温扩增技术同样由于假阳性较高，准确度低，水产病原检测中的应用还是比较局限。本专利技术建立了RAA恒温荧光来检测虾肝肠胞虫的方法，快速方便，准确可靠，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。重组酶介导扩增(Recombinase-aidAmplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供对虾肝肠胞虫(EHP)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。为实现以上目的，本专利技术采用以下技术方案：一种对虾肝肠胞虫(EHP)核酸的检测试剂盒，包括：对虾肝肠胞虫正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述对虾肝肠胞虫正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述对虾肝肠胞虫反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、对虾肝肠胞虫标准品和ddH2O中至少一种。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20％PEG；BBuffer为280mMMgAc。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μLSSB蛋白、120ng/μLrecA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μLRad51、30ng/μLBsuDNA聚合酶，100mmol/LTricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，对虾肝肠胞虫标准品为含有对虾肝肠胞虫SSU基因部分序列的阳性质粒。在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述含有对虾肝肠胞虫SSU基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种对虾肝肠胞虫的RAA恒温荧光检测方法，提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA为模板，在对虾肝肠胞虫的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、ABuffer、BBuffer和ddH2O存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述对虾肝肠胞虫正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述对虾肝肠胞虫反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述实施荧光RAA反应程序为：37℃，40s；37℃，20min，共计40个循环；本专利技术所述检测方法需要实时荧光RAA反应结束后，利用实时荧光RAA仪分析软件，根据实时荧光RAA的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为待测样本FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为对虾肝肠胞虫阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为对虾肝肠胞虫阴性结果。有益效果1、快速高效：整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到109-1010个拷贝；2、操作简单：不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变形等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件比较温和；3、高特异性：本专利技术对对虾其他的病症对虾传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)、对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)、对虾白斑综合症病毒(WSSV)、对虾桃拉综合症病毒(TSV)的DNA均不发生扩增。4、高灵敏度：本专利技术的检测极限可以达到100fg/反应5、鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，适合现场检测。附图说明图1为本专利技术中涉及的4对引物RAA扩增曲线图。图2为RAA检测方法对EHP的灵敏度实验图，从左到右依次为100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL的阳性标准品的扩增结果。图3为RAA检测方法对EHP的特异性实验图。具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对虾肝肠胞虫（EHP）核酸的检测试剂盒，包括：对虾肝肠胞虫正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述对虾肝肠胞虫正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述对虾肝肠胞虫反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种对虾肝肠胞虫（EHP）核酸的检测试剂盒，包括：对虾肝肠胞虫正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述对虾肝肠胞虫正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述对虾肝肠胞虫反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。3.根据权利要求1和2所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、对虾肝肠胞虫标准品和ddH2O中至少一种。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20%PEG；BBuffer为280mMMgAc。5.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μLSSB蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：程奇，钱冬，黄震巨，张建勋，肖文，余国君，陶智勇，徐锦余，霍胜楠，沈弘，郑晓叶，郑天伦，沈伟良，吕文浩，
申请(专利权)人：杭州众测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33