鳗鲡疱疹病毒（HVA）的RAA恒温荧光检测方法及试剂技术

本发明专利技术公开了一种鳗鲡疱疹病毒（HVA）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、重组聚合酶和对照品。本发明专利技术的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到0.4fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

RAA constant temperature fluorescence detection method and reagents for eel herpesvirus (HVA)

【技术实现步骤摘要】
鳗鲡疱疹病毒(HVA)的RAA恒温荧光检测方法及试剂
本专利技术属于分子生物学
，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种鳗鲡疱疹病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。
技术介绍
自20世纪70年代末我国引进鳗鲡养殖技术以来，已形成集养殖、加工、出口、饲料生产于一体的较为成熟的产业链，其产值在我国水产品出贸易中占有重要位置。由于大规模的集约化养殖，鳗鲡的重大病害发生日益频繁，严重阻碍了产业的健康发展。鳗鲡疱疹病毒(HVA)是一个普遍存在并对养殖的淡水鳗鲡造成巨大经济损失的病毒性病原。Sano等1990年从日本鳗鲡中首次分离出疱疹病毒；1993年Ueno等从台湾鹿港的养殖日本鳗鲡中分离出HVA。HVA在暴发时鳗鲡的临床症状有很大的不同，如引起鱼粘液分泌增多，病鱼眼突和腹胀，肝脏褪色，肾脏肿大、胆囊膨大、肠炎，表皮溃烂、穿孔并露出内脏，还有死亡率的增高。潜伏感染也是HVA的一个重要特征，在欧洲多地无发病症状的野生鳗鲡体内都可检测到病毒，阳性检出率达到了48％。由于我国在HVA的研究较少，使得一旦疾病暴发，应对措施较少而造成巨大的经济损失，因此对HVA的预防显得重要。对于病害检测这方面使用方法主要有镜检观察，分子检测和免疫学检测。PCR分子检测方法是最为常用的检测方法之一，其方法敏感、准确、快速而被广泛应用，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场检测和普及使用。本专利技术建立了RAA恒温荧光来检测鳗鲡疱疹病毒的方法，快速方便，准确可靠，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国水产养殖及其产品的贸易有重要作用。重组酶介导扩增(Recombinase-aidAmplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供鳗鲡疱疹病毒的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。为实现以上目的，本专利技术采用以下技术方案：一种鳗鲡疱疹病毒核酸的检测试剂盒，包括：鳗鲡疱疹病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述鳗鲡疱疹病毒正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述鳗鲡疱疹病毒反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、鳗鲡疱疹病毒标准品和ddH2O中至少一种。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20％PEG；BBuffer为280mMMgAc。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μLSSB蛋白、120ng/μLrecA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μLRad51、30ng/μLBsuDNA聚合酶，100mmol/LTricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，鳗鲡疱疹病毒标准品为含有鳗鲡疱疹病毒DNA聚合酶基因部分序列的阳性质粒。在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述含有鳗鲡疱疹病毒DNA聚合酶基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种鳗鲡疱疹病毒的RAA恒温荧光检测方法，提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA为模板，在鳗鲡疱疹病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、ABuffer、BBuffer和ddH2O存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述鳗鲡疱疹病毒正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述鳗鲡疱疹病毒反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中的应用，鳗鲡疱疹病毒DNA提取采用海洋动物组织DNA提取试剂盒或者采用等效的DNA提取试剂盒。在一些实施方案中，所述实施荧光RAA反应程序为：37℃，40s；37℃，20min，共计40个循环；本专利技术所述检测方法需要实时荧光RAA反应结束后，利用实时荧光RAA仪分析软件，根据实时荧光RAA的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为待测样本FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为鳗鲡疱疹病毒阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为鳗鲡疱疹病毒阴性结果。有益效果1、快速高效：整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到109-1010个拷贝；2、操作简单：不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变形等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件比较温和；3、高特异性：本专利技术对鱼类其他的病症IPNV、ISAV、SAV、VNNV、FBS和CEV的质粒均不发生扩增。4、高灵敏度：本专利技术的检测极限可以达到0.4fg/反应5、鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，适合现场检测。附图说明图1为本专利技术中涉及的4对引物HVA扩增曲线图。图2为RAA检测方法对HVA的灵敏度实验图，从左到右依次为4pg/μL、400fg/μL、40fg/μL、4fg/μL、0.4fg/μL的阳性标准品的扩增结果。图3为RAA检测方法对HVA的特异性实验图。具体实施方法以下通过具体实施例对本专利技术进一步说明，但并不局限于此。实施例1：本专利技术对鳗鲡疱疹病毒在Genebank数据库中搜索鳗鲡疱疹病毒DNA聚合酶基因序列，使用DNAMAN6.0软件对多序列进行比对，找出保守的区本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鳗鲡疱疹病毒（HVA）核酸的检测试剂盒，包括：鳗鲡疱疹病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述鳗鲡疱疹病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述鳗鲡疱疹病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。/n

【技术特征摘要】
1.一种鳗鲡疱疹病毒（HVA）核酸的检测试剂盒，包括：鳗鲡疱疹病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述鳗鲡疱疹病毒正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述鳗鲡疱疹病毒反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。


2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。


3.根据权利要求1和2所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、鳗鲡疱疹病毒标准品和ddH2O中至少一种。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20%PEG；BBuffer为280mMMgAc。


5.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μLSSB蛋白、120ng/μLrecA重组酶蛋白（SC-recA/BS...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑晓聪，钱冬，程奇，史秀杰，刘荭，张建勋，肖文，余国君，贾鹏，王津津，于力，何俊强，刘莹，温智清，
申请(专利权)人：杭州众测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33