本发明专利技术公开了一种传染性鲑鱼贫血症病毒（ISAV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、逆转录酶、重组聚合酶和对照品。本发明专利技术的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到2.72fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。
RAA constant temperature fluorescence detection method and reagent for infectious salmon anaemia virus (ISAV)
【技术实现步骤摘要】
传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)的RAA恒温荧光检测方法及试剂
本专利技术属于分子生物学
，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种传染性鲑鱼贫血症病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。
技术介绍
传染性鲑鱼贫血症病毒(infectioussalmonanaemiavirus，ISAV)于1984年在挪威首次出现，是一种海洋病毒，主要感染大西洋鲑鱼(Salmosalar)，可引起严重贫血、程度不同的出血和多组织坏死，是大西洋鲑鱼全身性和致死性的传染病。传染性鲑鱼贫血症病毒是一种正粘病毒，直径100～130nm，由8个基因组片段组成。传染性鲑鱼贫血症是世界动物卫生组织(OIE)水生动物疫病名录中的重要疫病之一，主要在欧洲、北美广泛流行，被列入欧共体鱼类健康指令防治的重要病害之一。因此建立快速而准确的ISAV检测方法，对保护我国的水产养殖业具有重要的意义。重组酶介导扩增(Recombinase-aidAmplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。为实现以上目的，本专利技术采用以下技术方案：一种传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)核酸的检测试剂盒，包括：传染性鲑鱼贫血症病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述传染性鲑鱼贫血症病毒正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述传染性鲑鱼贫血症病毒反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、传染性鲑鱼贫血症病毒标准品和DEPC处理水中至少一种。在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述的逆转录体系由RTE逆转录酶、RNA酶抑制剂组成。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20％PEG；BBuffer为280mMMgAc。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μLSSB蛋白、120ng/μLrecA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μLRad51、30ng/μLBsuDNA聚合酶，30ng/mLRTE逆转录酶、100mmol/LTricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，传染性鲑鱼贫血症病毒标准品为含有传染性鲑鱼贫血症病毒保守基因部分序列的阳性质粒。在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述含有传染性鲑鱼贫血症病毒保守区域基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种传染性鲑鱼贫血症病毒的RAA恒温荧光检测方法，提取待测样品的RNA，以待测样品的RNA为模板，在传染性鲑鱼贫血症病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、ABuffer、BBuffer和DEPC处理水存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述对传染性鲑鱼贫血症病毒正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述传染性鲑鱼贫血症病毒反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述实施荧光RAA反应程序为：37℃，40s；37℃，20min，共计40个循环；本专利技术所述检测方法需要实时荧光RAA反应结束后，利用实时荧光RAA仪分析软件，根据实时荧光RAA的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为待测样本FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为对传染性鲑鱼贫血症病毒阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为对传染性鲑鱼贫血症病毒阴性结果。有益效果1、快速高效：整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到109-1010个拷贝；2、操作简单：不需要特殊试剂，不需要预先进行RNA的逆转录等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件比较温和；3、高特异性：本专利技术对鱼其他的病症鲑鱼甲病毒(SAV)、传染性胰腺坏死病(IPNV)、鳗鲡疱疹病毒(HVA)、鲤鱼浮肿病(CEV)、病毒性神经坏死病(VNNV)和细菌性败血症(FBS)的DNA/RNA均不发生扩增；4、高灵敏度：本专利技术的检测极限可以达到2.72fg/μL；5、鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，适合现场检测。附图说明图1为本专利技术中涉及的4对引物RAA扩增曲线图。图2为RAA检测方法对ISAV的灵敏度实验图，从左到右依次为2722fg/μL、272.2fg/μL、27.22fg/μL、2.72fg/μL、0.27fg/μL的阳性标准品的扩增结果。图3为RAA检测方法对ISAV的特异性实验图。具体实施方法以下通过具体实施例对本专利技术进一步说明，但并不局限于此。实施例1：本专利技术对传染性鲑鱼贫血症病毒在Genebank数据库中搜索传染性鲑鱼贫血症病毒株基因序列，使用DNAMAN6.0软件对多序列进行比对，找出保守的区段。在保守区域设计了4组引物和探针，并在NCBI数据库中进行BLAST比对，引物和探针的序列如表1所示。阳性样本扩增曲线如图1所示。表1引物和探针序列:由图1结果可见，第四组引物和探针的扩增曲线最为典型，有明显的指数期和平台期，有较高荧光强度(纵坐标值)，且CT值较小(曲线与阈值线的交叉点所对应的横坐标)结果分析见表本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种传染性鲑鱼贫血症病毒（ISAV）核酸的检测试剂盒，包括：传染性鲑鱼贫血症病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述传染性鲑鱼贫血症病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述传染性鲑鱼贫血症病毒反向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。/n
【技术特征摘要】
1.一种传染性鲑鱼贫血症病毒（ISAV）核酸的检测试剂盒，包括：传染性鲑鱼贫血症病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述传染性鲑鱼贫血症病毒正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述传染性鲑鱼贫血症病毒反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。
3.根据权利要求1和2所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、传染性鲑鱼贫血症病毒标准品和DEPC处理水中至少一种。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述的逆转录体系由RTE逆转录酶、RNA酶抑制剂组成。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20%PEG；BBuffer为280mMMgAc。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾鹏，钱冬，程奇，温智清，刘荭，张建勋，肖文，余国君，史秀杰，郑晓聪，王津津，于力，何俊强，刘莹，
申请(专利权)人：杭州众测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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