鲑鱼甲病毒（SAV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂技术

本发明专利技术公开了一种鲑鱼甲病毒（SAV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、逆转录酶、重组聚合酶和对照品。本发明专利技术的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到1.93fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

RAA constant temperature fluorescence detection method and reagent for salmon armour virus (SAV)

【技术实现步骤摘要】
鲑鱼甲病毒(SAV)的RAA恒温荧光检测方法及试剂
本专利技术属于分子生物学
，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种鲑鱼甲病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。
技术介绍
鲑鱼甲病毒((Salmonidalphavirus，SAV)自20世纪90年代末开始流行于爱尔兰、挪威、英国等国家，主要感染大西洋鲑(Salmosalar)和虹鳟(Oncorhynchusmykiss)等鲑科鱼类，引起胰腺、心肌炎症和昏睡等症状，致死率达1％～48％，在鱼类养殖各生长阶段均有爆发。又被称为鲑鱼胰腺病或昏睡病。2013年鲑鱼甲病毒感染被列入OIE水生动物疫病名录中。鲑鱼甲病毒隶属于披膜病毒科(Togaviridae)，甲病毒属(Alphavirus)的RNA型病毒，，球型(直径55-65nm)，对氯仿敏感，在pH4.0、pH12.0和60℃时迅速灭活，在氯化铯中的浮力密度为1.20g/mL。受鲑鱼甲病毒感染的病鱼一般食欲减退、昏睡、眼突、腹水以及粪便拖尾，无法保持在水中的位置，螺旋或绕圈地游动，或者在水底不动，但抓捕时会游开，有时出现突然死亡。解剖发现病鱼心脏苍白，肠道空虚，有黄色黏液，体内脂肪很少，有时在幽门盲肠和四周的脂肪出现瘀斑出血；胰腺、心肌和骨骼肌病变是比较主要的症状。近年来基于临床组织病理学、免疫学以及PCR技术等的各种诊断方法已被用于SAV的检测。但是现有的这些方法都存在一定的不足，例如：基于组织病理学的方法不仅操作繁琐、费时，而且灵敏度较低；基于免疫学的方法虽然具有敏感性高、检测快速等特点，可用于大批标本的检测，但对新鲜样品进行检测时出现的假阳性问题在一定程度上还限制着该方法的广泛应用；而PCR方法敏感、准确、快速，可替代病原学检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。与一般PCR技术相比，荧光PCR检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR耗时长，成本较高，目前在水产养殖动物的常规病原体检测中的应用还不多。LAMP等温扩增技术同样由于假阳性较高，准确度低，水产病原检测中的应用还是比较局限。本专利技术建立了RAA恒温荧光来检测SAV的方法，快速方便，准确可靠，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。重组酶介导扩增(Recombinase-aidAmplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供鲑鱼甲病毒(SAV)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。为实现以上目的，本专利技术采用以下技术方案：一种鲑鱼甲病毒(SAV)核酸的检测试剂盒，包括：鲑鱼甲病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述鲑鱼甲病毒正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述鲑鱼甲病毒反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、鲑鱼甲病毒标准品和DEPC处理水中至少一种。在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述的逆转录体系由RTE逆转录酶、RNA酶抑制剂组成。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20％PEG；BBuffer为280mMMgAc。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μLSSB蛋白、120ng/μLrecA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μLRad51、30ng/μLBsuDNA聚合酶，30ng/mLRTE逆转录酶、100mmol/LTricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，鲑鱼甲病毒标准品为含有鲑鱼甲病毒保守基因部分序列的阳性质粒。在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述含有鲑鱼甲病毒保守区域基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种鲑鱼甲病毒的RAA恒温荧光检测方法，提取待测样品的RNA，以待测样品的RNA为模板，在鲑鱼甲病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、ABuffer、BBuffer和DEPC处理水存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述对鲑鱼甲病毒正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述鲑鱼甲病毒反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述实施荧光RAA反应程序为：37℃，40s；37℃，20min，共计40个循环；本专利技术所述检测方法需要实时荧光RAA反应结束后，利用实时荧光RAA仪分析软件，根据实时荧光RAA的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为待测样本FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为对鲑鱼甲病毒阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为对鲑鱼甲病毒阴性结果。有益效果1、快速高效：整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到109-1010个拷贝；2、操作简单：不需要特殊试剂，不需要预先进行RNA的逆转录等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件比较温和；3、高特异性：本专利技术对鱼其他的病症传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)、草鱼出血病(GCRV-Ⅰ)、鳗鲡疱疹病毒(HVA)、鲤鱼浮肿病(CEV)和细菌性败血症(FBS)的DNA/RNA均不发生扩增；4、高灵敏度：本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鲑鱼甲病毒（SAV）核酸的检测试剂盒，包括：鲑鱼甲病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述鲑鱼甲病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述鲑鱼甲病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。/n

【技术特征摘要】
1.一种鲑鱼甲病毒（SAV）核酸的检测试剂盒，包括：鲑鱼甲病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述鲑鱼甲病毒正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述鲑鱼甲病毒反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。


2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。


3.根据权利要求1和2所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、鲑鱼甲病毒标准品和DEPC处理水中至少一种。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述的逆转录体系由RTE逆转录酶、RNA酶抑制剂组成。


5.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20%PEG；BBuffer为280mMMgAc。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑晓聪，钱冬，程奇，史秀杰，刘荭，张建勋，肖文，余国君，贾鹏，王津津，于力，何俊强，刘莹，温智清，
申请(专利权)人：杭州众测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33