本发明专利技术公开了一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360‑505R基因缺失株LAMP检测引物及其试剂盒，所述LAMP检测引物包含两套引物，分别针对非洲猪瘟病毒野毒株保守的衣壳蛋白基因P72(B646L)序列和非洲猪瘟MGF360‑505R基因缺失株第27942‑35500位缺失区两侧，能特异性的检测出该非洲猪瘟MGF360‑505R基因缺失株。本方法采用恒温反应的检测手段，仅需加热即可实现整个反应，检测结果可以直接目测，适合现场检测；所述方法检测灵敏度高、特异性强、重复性好、检测速度快，可以作为有效鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360‑505R基因缺失株的基层检测手段。
A lamp detection primer and kit for distinguishing between African classical swine fever virus wild strain and gene deletion strain
【技术实现步骤摘要】
一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的LAMP检测引物及试剂盒
本专利技术属于生物
，更具体地，涉及一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的LAMP检测引物及试剂盒。
技术介绍
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。患猪临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，最急性和急性感染死亡率高达100％。家猪、野猪与软蜱是非洲猪瘟自然宿主，非洲猪瘟可在家猪与野猪之间直接传播，也可由软蜱叮咬传播，还可以通过病毒污染的泔水、饲料及各种猪肉制品跨国家和地区传播。发现疫情必须扑杀进行无害化处理，其广泛危害全球猪群，是我国重点防范的外来动物传染病。尚无有效的商品化预防疫苗及特效药。目前CN110093324A公开了一种可作为疫苗的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒及疫苗以及构建方法，采用非洲猪瘟中国流行株Pig/CN/HLJ/2018，经基因工程技术，将非洲猪瘟病毒的毒力基因缺失，获得MGFMGF360-505R缺失和CD2V与MGFMGF360-505R联合缺失的基因缺失病毒。经实验表明所述两种毒株均能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护，可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫情的疫苗，具有极大的社会价值。但该疫苗的使用会导致常规方法检测非洲猪瘟病毒结果钧为阳性，无法区分野毒感染致阳性，还是疫苗接种导致阳性。实验室检测经常用到的方法包括：电镜观察，ELISA，细胞转染(CFT)和血清中和试验；感染组织的组织病理学；以及核酸检测，包括PCR和实时定量PCR(RFLP)。然而，以上核酸检测方法虽然能够实现非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的准确检测，但是其都是属于实验室检测手段，需要借助复杂的仪器和严苛的实验条件，并不适合养殖场和基层单位的现场检测。
技术实现思路
本专利技术第一个方面的目的，针对非洲猪瘟病毒普通检测方法不能区分病毒感染或是疫苗接种的情形，而常规核酸检测手段不便、对仪器的依赖性比较强，不能实现现场检测的技术问题，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的LAMP检测引物组。本专利技术第二个方面的目的，在于提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的LAMP检测试剂盒。本专利技术第三个方面的目的，在于提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的LAMP检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一个方面，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的LAMP检测引物组，包括以下A、B两组引物，每组引物包括：一对外引物、一对内引物及一对环引物，A组：外引物：P72-F3：TACTGTAACGCAGCACAG(SEQIDNO:1)；P72-B3：CGATAAATTTCCATCAAAGTTCTG(SEQIDNO:2)；内引物：P72-FIP：TAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTGAAAGTTAATAGCAGATGCCG(SEQIDNO:3)；P72-BIP：ATGACCACTGGGTTGGTATTCCAATGCGATTAAAACCCCCG(SEQIDNO:4)；环引物：P72-LF：CACTACGGCTGATCTTGTGGTAT(SEQIDNO:5)；P72-LB：CCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATC(SEQIDNO:6)；B组：外引物：MGF360-505RQS-F3：GGATTATACTGGGAAAACCAT(SEQIDNO:7)；MGF360-505RQS-B3：GCTGATATTTTTTAGCCAGAGTT(SEQIDNO:8)；内引物：MGF360-505RQS-FIP：CAGGGCTTCATTTACGGGAATGATTTTCGAGCAGGAAACAACTGT(SEQIDNO:9)；MGF360-505RQS-BIP：GCAGCGAGACGTTTCAATAAAAGTTTTCTATCTCCTTGCTTCCACC(SEQIDNO:10)；环引物：MGF360-505RQS-LF：CAACTGTGTGCTTATACAGCAAC(SEQIDNO:11)；MGF360-505RQS-LB：GGCTTCTACCCTTTGTAATCAAAAC(SEQIDNO:12)。本专利技术的第二个方面，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的LAMP检测试剂盒，所述试剂盒中包含本专利技术第一个方面所述的引物组。根据本专利技术第二个方面所述的试剂盒，所述试剂盒中还包括BstDNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。根据本专利技术第二个方面所述的试剂盒，所述LAMP反应液含有10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液。根据本专利技术第二个方面所述的试剂盒，所述阳性对照为含有非洲猪瘟病毒P72基因片段的质粒和含有非洲猪瘟病毒缺失第27942-35500位两侧区域片段的质粒。根据本专利技术第二个方面所述的试剂盒，所述含有非洲猪瘟病毒P72基因片段的序列如SEQIDNo.13所示，所述缺失第27942-35500位两侧区域片段的序列如SEQIDNo.14所示。根据本专利技术第二个方面所述的试剂盒，所述试剂盒中两组引物的外引物、环引物，内引物的摩尔比为1:5:10。本专利技术的第三个方面，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株LAMP检测方法，包括以下步骤：S1.提取待测样品DNA；S2.以步骤S1中提取的核酸为模板，配置两个25μL反应体系，包括引物、DNA聚合酶、LAMP反应液和待测样品DNA，用无菌水补齐到25μL，然后千63～68℃下反应30～60min，所述两个25μL反应体系分别含有权利要求1中所述的两组引物中的一组；S3.通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳验证，确定病毒类型。根据本专利技术第三个方面所述的方法，步骤S3所述确定病毒类型的方法为：当两个反应管均未变浑浊，则说明未检测到非洲猪瘟病毒；当两个反应管均变浑浊，则说明样品中含有MGF360-505R基因缺失株；当A组引物反应管变浑浊，B组引物反应管未变浑浊，则说明样品是野毒株并且不含MGF360-505R基因缺失株。根据本专利技术第三个方面所述的方法，步骤S3所述确定病毒类型的方法为：当两个反应管的琼脂糖凝胶电泳均无梯状条带，则说明未检测到非洲猪瘟病毒；当两个反应管的琼脂糖凝胶电泳均有梯状条带，则说明样品中含有MGF360-505R基因缺失株；当A组引物反应管的琼脂糖凝胶电本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的LAMP检测引物组，包括以下A、B两组引物，每组引物包括：一对外引物、一对内引物和一对环引物，/nA组：/n外引物：/nP72-F3：TACTGTAACGCAGCACAG(SEQ ID NO:1)；/nP72-B3：CGATAAATTTCCATCAAAGTTCTG(SEQ ID NO:2)；/n内引物：/nP72-FIP：TAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTGAAAGTTAATAGCAGATGCCG(SEQ ID NO:3)；/nP72-BIP：ATGACCACTGGGTTGGTATTCCAATGCGATTAAAACCCCCG(SEQ ID NO:4)；/n环引物：/nP72-LF：CACTACGGCTGATCTTGTGGTAT(SEQ ID NO:5)；/nP72-LB：CCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATC(SEQ ID NO:6)；/nB组：/n外引物：/nMGF360-505RQS-F3：GGATTATACTGGGAAAACCAT(SEQ ID NO:7)；/nMGF360-505RQS-B3：GCTGATATTTTTTAGCCAGAGTT(SEQ ID NO:8)；/n内引物：/nMGF360-505RQS-FIP：/nCAGGGCTTCATTTACGGGAATGATTTTCGAGCAGGAAACAACTGT(SEQ ID NO:9)；/nMGF360-505RQS-BIP：/nGCAGCGAGACGTTTCAATAAAAGTTTTCTATCTCCTTGCTTCCACC(SEQ ID NO:10)；/n环引物：/nMGF360-505RQS-LF：CAACTGTGTGCTTATACAGCAAC(SEQ ID NO:11)；/nMGF360-505RQS-LB：GGCTTCTACCCTTTGTAATCAAAAC(SEQ ID NO:12)。/n...
【技术特征摘要】
1.一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的LAMP检测引物组，包括以下A、B两组引物，每组引物包括：一对外引物、一对内引物和一对环引物，
A组：
外引物：
P72-F3：TACTGTAACGCAGCACAG(SEQIDNO:1)；
P72-B3：CGATAAATTTCCATCAAAGTTCTG(SEQIDNO:2)；
内引物：
P72-FIP：TAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTGAAAGTTAATAGCAGATGCCG(SEQIDNO:3)；
P72-BIP：ATGACCACTGGGTTGGTATTCCAATGCGATTAAAACCCCCG(SEQIDNO:4)；
环引物：
P72-LF：CACTACGGCTGATCTTGTGGTAT(SEQIDNO:5)；
P72-LB：CCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATC(SEQIDNO:6)；
B组：
外引物：
MGF360-505RQS-F3：GGATTATACTGGGAAAACCAT(SEQIDNO:7)；
MGF360-505RQS-B3：GCTGATATTTTTTAGCCAGAGTT(SEQIDNO:8)；
内引物：
MGF360-505RQS-FIP：
CAGGGCTTCATTTACGGGAATGATTTTCGAGCAGGAAACAACTGT(SEQIDNO:9)；
MGF360-505RQS-BIP：
GCAGCGAGACGTTTCAATAAAAGTTTTCTATCTCCTTGCTTCCACC(SEQIDNO:10)；
环引物：
MGF360-505RQS-LF：CAACTGTGTGCTTATACAGCAAC(SEQIDNO:11)；
MGF360-505RQS-LB：GGCTTCTACCCTTTGTAATCAAAAC(SEQIDNO:12)。
2.一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1中所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括BstDNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈永义，王瑞晨，陈瑞爱，杨柔，
申请(专利权)人：华南农业大学，肇庆大华农生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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