用于检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的冻干微芯片、试剂盒及方法技术

本发明专利技术“用于检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的冻干微芯片、试剂盒及方法”，属于分子检测领域。用于检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述微芯片上；所述荧光PCR反应体系包括：猪蓝耳病毒株通用上游引物，猪蓝耳病毒株通用下游引物，猪蓝耳病毒株通用Taqman探针序列；高致病经典变异株上游引物；高致病经典变异株下游引物，高致病经典变异株Taqman探针序列。本发明专利技术可检测猪蓝耳病毒毒株和并可鉴别猪蓝耳病毒高致病经典变异株，所述检测试剂盒检测方法准确性、特异性和敏感性高，检测时间短。

A freeze-dried microchip, kit and method for the detection of porcine blue ear virus and the identification of the highly pathogenic classical variant strain of porcine blue ear virus from China

【技术实现步骤摘要】
用于检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的冻干微芯片、试剂盒及方法
本专利技术涉及病毒的分子生物学检测
，特别是涉及用于检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的冻干微芯片、试剂盒及方法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)俗称“猪蓝耳病毒”。该病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起猪发生繁殖与呼吸障碍的一种重要疫病。PRRSV主要感染猪，尤其是母猪，该病严重影响其生殖功能，临床主要特征为流产，产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难，在发病过程中会出现短暂性的两耳皮肤紫绀，故又称为蓝耳病。它是近些年危害猪场的头号疾病，不仅会造成母猪出现流产、死胎、发情异常、免疫抑制，还会导致商品猪出现腹泻、呼吸道疾病，严重影响猪只生长速度与健康。猪蓝耳病毒包括:欧洲型毒株、高致病经典变异毒株、国内经典株、美国经典株、GM2类重组毒株(美国经典毒株和中国变异毒株重组)以及NADC-30类毒株(包含NADC-30株和NADC30-like株)。其中，高致病经典变异株是自2006年在江西发现，继而全国流行，其具有高热、高感染率和高死亡率3大特点，成为国内主要流行的猪蓝耳高致病性毒株。近年来，虽然各国科学家已对PRRSV进行了多方面的研究，但至今还未找到有效根除PRRS的方法，其防控有赖于及时准确地诊断和疫情的控制。诊断是防控的基础不同基因型和致病性的PRRSV毒株抗原性差异较大、诊断技术和防控疫苗等均有不同，依据检测目的不同分类型诊断是该病防控的首要之举。目前对猪蓝耳病毒的检测所采用的方法主要还是传统的病毒分离鉴定、ELISA方法及普通PCR检测。病毒分离操作烦琐，耗时长，漏检率高；ELISA方法相对简便，快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低，可能造成漏诊或误诊。PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于其特异性、敏感性高，能在短时间内通过基因扩增得到大量的目的片段，使之成为目前PRRSV检测的重要手段之一。但普通PCR仍存在操作繁琐、检测时间长且易污染等弊端。所以目前市场急需快速、准确、灵敏度高，且便携，能现场操作的检测猪蓝耳病毒和并鉴别猪蓝耳高致病经典变异株的试剂产品。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的冻干微芯片荧光RT-PCR试剂盒，使其能够快速、有效地对猪蓝耳病毒进行检测，准确性、特异性和敏感性高，重复性好。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：用于检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的冻干微芯片，其特征在于，用于检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述微芯片上；所述荧光PCR反应体系包括：下述引物和探针：猪蓝耳病毒株通用上游引物：5＇-GCGGGCTTTCATCCGATT-3＇，猪蓝耳病毒株通用下游引物：5＇-GACGCCGGACGACAAATG-3＇，猪蓝耳病毒株通用Taqman探针序列：5＇-CGGCAAATGATAACCAC-3＇；高致病经典变异株上游引物：5＇-CAACCGAGCAACCTCATATCA-3＇，高致病经典变异株下游引物：5＇-AGTGAGAAGGCGGTCAAAGG-3＇，高致病经典变异株Taqman探针序列：5＇-CTCATGCTGCACTCTG-3＇。所述荧光PCR反应体系还包括：Taq酶、反转录酶、海藻糖、Tris-Cl、dNTP、Mg2+；优先地，所述高致病经典变异株和猪蓝耳病毒株通用的Taqman探针的5`端标记有荧光报告基团；3`端标记有荧光淬灭基团。所述荧光PCR反应体系包括：上游引物0.4μM；下游引物0.4μM；Taqman探针0.4μM；DNA聚合酶0.5U/μL；反转录酶0.5U/μL；dNTP0.3mM；Mg2+3mM；海藻糖5μM；Tris-Cl5mM，其余为灭菌去离子水，总体积为36μL，每孔体积为1.2μL；优先地，所述猪蓝耳病毒株通用的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为FAM荧光报告基团；所述猪蓝耳病毒高致病经典变异株的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为ROX荧光报告基团；所述高致病经典变异株和猪蓝耳病毒株通用的Taqman探针3`端标记的荧光淬灭基团为MGB淬灭基团。所述微芯片上设置有若干个加样孔；所述荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述加样孔内；优选地，所述微芯片上的加样孔为30个；所述微芯片的结构与PCR仪的加样板结构相适配；具体地，所述猪蓝耳病毒株指：包含所述猪蓝耳高致病经典变异株在内的所有猪蓝耳病毒株。所述冻干包括如下步骤：将装有所述荧光PCR反应体系的微芯片置于-80℃冷冻1h后再进行设备冻干；优选地，所述设备冻干包括：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。用于鉴别猪蓝耳高致病经典变异株与猪蓝耳病毒株的试剂盒，包括所述的冻干微芯片。所述试剂盒还包括：稀释液和无核酸酶水，10×稀释液使用无核酸酶水稀释成2×稀释液用于滴入冻干微芯片的加样孔中，再将冻干微芯片置于荧光PCR仪上进行荧光PCR扩增。所述试剂盒还包括：矿物油，封闭所述冻干微芯片上的加样孔；阳性对照，具体为高致病猪蓝耳经典变异株病毒的cDNA；阴性对照，具体为无核酸酶水。用于检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的方法，其特征在于，采用所述的冻干微芯片，和/或，所述的试剂盒对待测样品进行荧光PCR扩增。在冻干微芯片的加样孔中加入待测样品及稀释液后，将冻干微芯片置于荧光PCR仪上进行所述荧光PCR扩增；优选地，所述稀释液为10×buffer，使用前需使用无核酸酶水将其稀释成2×buffer，每孔加入量为0.6μL；进一步优选地，所述荧光PCR扩增的反应程序为：50℃10min；95℃1min；以95℃5s，60℃15s为1个循环，进行40个循环，每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。本专利技术提供一种检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的冻干微芯片荧光RT-PCR试剂盒，包括PCR冻干微芯片，所述PCR冻干微芯片包括具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针：猪蓝耳病毒株通用上游引物：5＇-GCGGGCTTTCATCCGATT-3＇，猪蓝耳病毒株通用下游引物：5＇-GACGCCGGACGACAAATG-3＇，猪蓝耳病毒株通用Taqman探针：5＇FAM-CGGCAAATGATAACCAC-MGB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的冻干微芯片，其特征在于，用于检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述微芯片上；/n所述荧光PCR反应体系包括：下述引物和探针：/n猪蓝耳病毒株通用上游引物：5＇-GCGGGCTTTCATCCGATT-3＇，/n猪蓝耳病毒株通用下游引物：5＇-GACGCCGGACGACAAATG-3＇，/n猪蓝耳病毒株通用Taqman探针序列：/n5＇-CGGCAAATGATAACCAC-3＇；/n高致病经典变异株上游引物：5＇-CAACCGAGCAACCTCATATCA-3＇，/n高致病经典变异株下游引物：5＇-AGTGAGAAGGCGGTCAAAGG-3＇，/n高致病经典变异株Taqman探针序列：5＇-CTCATGCTGCACTCTG-3＇。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的冻干微芯片，其特征在于，用于检测猪蓝耳病毒并鉴别从中猪蓝耳病毒高致病经典变异株的荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述微芯片上；
所述荧光PCR反应体系包括：下述引物和探针：
猪蓝耳病毒株通用上游引物：5＇-GCGGGCTTTCATCCGATT-3＇，
猪蓝耳病毒株通用下游引物：5＇-GACGCCGGACGACAAATG-3＇，
猪蓝耳病毒株通用Taqman探针序列：
5＇-CGGCAAATGATAACCAC-3＇；
高致病经典变异株上游引物：5＇-CAACCGAGCAACCTCATATCA-3＇，
高致病经典变异株下游引物：5＇-AGTGAGAAGGCGGTCAAAGG-3＇，
高致病经典变异株Taqman探针序列：5＇-CTCATGCTGCACTCTG-3＇。


2.根据权利要求1所述的冻干微芯片，其特征在于，所述荧光PCR反应体系还包括：Taq酶、反转录酶、海藻糖、Tris-Cl、dNTP、Mg2+；
优先地，所述高致病经典变异株和猪蓝耳病毒株通用的Taqman探针的5`端标记有荧光报告基团；3`端标记有荧光淬灭基团。


3.根据权利要求1或2所述的冻干微芯片，其特征在于，所述荧光PCR反应体系包括：上游引物0.4μM；下游引物0.4μM；Taqman探针0.4μM；DNA聚合酶0.5U/μL；反转录酶0.5U/μL；dNTP0.3mM；Mg2+3mM；海藻糖5μM；Tris-Cl5mM，其余为灭菌去离子水，总体积为36μL，每孔体积为1.2μL；
优先地，所述猪蓝耳病毒株通用的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为FAM荧光报告基团；
所述猪蓝耳病毒高致病经典变异株的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为ROX荧光报告基团；
所述高致病经典变异株和猪蓝耳病毒株通用的Taqman探针3`端标记的荧光淬灭基团为MGB淬灭基团。


4.根据权利要求1-3任一所述的冻干微芯片，其特征在于，所述微芯片上设置有若干个加样孔；所述荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：王新杰，高姗姗，孙晓明，胡祥钰，刘玉良，韩焘，王传彬，杨林，
申请(专利权)人：北京亿森宝生物科技有限公司，中国动物疫病预防控制中心农业部屠宰技术中心，
类型：发明
国别省市：北京;11