【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及家禽养殖，尤其涉及鸡毒支原体和禽滑液囊支原体双重raa-crispr检测的方法及应用。
技术介绍
1、鸡毒支原体(mycoplasma gallisepticum，mg)和鸡滑液囊支原体(mycoplasmasynoviae，ms)是对家禽养殖危害最大的两种支原体。鸡毒支原体感染是鸡呼吸道病的一种，主要引起慢性呼吸道病，眶下窦炎。随着养鸡规模加大、饲养方式改变和饲养密度提高，该病发病率越来越高，主要影响雏鸡生长、使成年鸡产蛋减少，造成养鸡业经济上的重大损失，危害性日益突出，受到养鸡业者的普遍关注。
2、重组酶介导链替换核酸扩增(raa)技术，是一种恒温核酸快速扩增技术，利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在常温下，该重组酶可与引物dna紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板dna上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链结合蛋白的帮助下，打开模板dna的双链结构，并在dna聚合酶的作用下，形成新的dna互补链，扩增产物以指数级增长。
3、crispr/cas系统中crispr是“clustered regμlarly interspaced shortpalindromic repeats”缩写，指规律成簇的间隔短回文重复。cas是“crispr associated”缩写，为crispr相关。
4、crispr/cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的二次免疫类似，当细菌遭受病毒或者
5、基于crispr/cas系统能够切断外源dna的特性，cas蛋白在crrna的引导下特异性识别靶标后，可被激活针对ssdna或ssrna的反式剪切活性，通过fam、生物素等报告探针标记荧光基团和bhq1等淬灭基团，检测结果被转化为可视化的荧光信号或试纸条条带，因此，crispr/cas系统具备检测核酸的潜力。
6、现有技术中，还未实现基于raa和crispr/cas技术检测鸡毒支原体和禽滑液囊支原体。
技术实现思路
1、本专利技术提供鸡毒支原体和禽滑液囊支原体双重raa-crispr检测的方法及应用。
2、第一方面，本专利技术提供了鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的raa引物组合，包括：扩增鸡毒支原体的raa引物对，其序列如seq id no.1-2所示，和扩增禽滑液囊支原体的raa引物对，其序列如seq id no.4-5所示。
3、第二方面，本专利技术提供了基于crispr/cas技术检测鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的crrna分子，所述鸡毒支原体的crrna分子为cas12a-crrna，其序列如seq id no.3所示；所述禽滑液囊支原体的crrna分子为cas13a-crrna，其序列如seq id no.6所示。
4、第三方面，本专利技术提供了鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的双重raa-crispr/cas反应体系，包括：上述的raa引物组合和上述的crrna分子；还包括：序列如fam-tttttttttt-bhq1所示的cas12a-ssdna报告基因，和序列如rox-uuuuuuuu-bhq2所示的cas13a-ssrna报告基因。
5、在本专利技术提供的鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的双重raa-crispr/cas反应体系中，lbcas12a蛋白与cas12a-crrna的浓度比为(0.6-1)：(0.8-2)；鸡毒支原体raa上下游引物与cas12a-ssdna报告基因的浓度比为(2000～6000)：(0.1～0.5)。
6、优选地，在本专利技术提供的鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的双重raa-crispr/cas反应体系中，lbcas12a蛋白与cas12a-crrna的浓度比为0.8：1.2；鸡毒支原体raa上下游引物与cas12a-ssdna报告基因的浓度比为4000：0.2。
7、在本专利技术提供的鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的双重raa-crispr/cas反应体系中，lbcas13a蛋白与cas13a-crrna的浓度比为4：0.4；禽滑液囊支原体raa上下游引物与cas13a-ssrna报告基因的浓度比为4000：1。
8、作为本专利技术的具体实施方式，本专利技术提供的鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的双重raa-crispr/cas反应体系，包括：2～10mmol/l dntp、0.2～1.0μmol/l单链结合蛋白、1.0～2.0μmol/l重组酶蛋白、0.2～1.0u/μl dna聚合酶、10～50mmol trishcl、40～80mmolnacl、6～10mmol/l二硫苏糖醇、1.0～5.0μmol/l鸡毒支原体raa上下游引物、1.0～5.0μmol/l禽滑液囊支原体raa上下游引物、1～2μmol/l cas12a-crrna、0.5～1.0μmol/llbcas12a、0.1～0.5nmol/l cas12a-ssdna报告基因、0.2～0.8μmol/lcas13a-crrna、1～5μmol/l lbcas13a、0.5～1.5nmol/l cas13a-ssrna报告基因、0.4～1.0u/μl rnaseinhibitor、0.4～1.0u/μl t7 rnapolymerase、0.1-1u/μl exo核酸外切酶。
9、本专利技术将含有上述鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的双重raa-crispr/cas反应体系作为冻干液进行冻干获得冻干粉，或将含有上述鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的双重raa-crispr/cas反应体系的冻干液先注入反应管中，再进行冻干，获得一管式冻干管。
10、更具体地，本专利技术所提供的冻干液中还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂为：10～15mmol/l海藻糖、20～25mmol/l甘露醇、5～20％牛血清白蛋白。
11、基于此，本专利技术第四方面，提供同时检测鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的一管式冻干管，检测鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的反应体系通过冻干被固定在所述一管式冻干管中，所述检测鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的反应体系中含有上述的双重raa-crispr/cas反应体系。
12、本专利技术第五方面，提供上述一管式冻干管的制备方法，所述冻干的条件包括：将装有所述双重raa-crispr/cas反应体系的一管式冻干管先于-80℃冷冻1～1.5h再进行设备冻干；所述设备冻干包括：预冻阶段、设备抽真空、冷冻干燥和解析干燥阶段；所述解析干燥阶段的条件为：将隔板温度升至-20～-25℃保持12～16h，然后将隔板温度升至4～8℃并保持0.5～1h，最后将隔板降至20～25℃并保持3～5h。
13、第五方面，本专利技术提供同时检测鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的检测试剂盒，所述检测试剂盒含有上述的raa引本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的RAA引物组合，其特征在于，包括：扩增鸡毒支原体的RAA引物对，其序列如SEQ ID NO.1-2所示，和扩增禽滑液囊支原体的RAA引物对，其序列如SEQ ID NO.4-5所示。
2.基于CRISPR/CAS技术检测鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的crRNA分子，其特征在于，所述鸡毒支原体的crRNA分子为Cas12a-crRNA，其序列如SEQ ID NO.3所示；所述禽滑液囊支原体的crRNA分子为Cas13a-crRNA，其序列如SEQ ID NO.6所示。
3.鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的双重RAA-CRISPR/CAS反应体系，其特征在于，包括：权利要求1所述的RAA引物组合和权利要求2所述的crRNA分子；还包括：序列如FAM-TTTTTTTT TT-BHQ1所示的Cas12a-ssDNA报告基因，和序列如ROX-UUUUUUUU-BHQ2所示的Cas13a-ssRN A报告基因。
4.根据权利要求3所述的双重RAA-CRISPR/CAS反应体系，其特征在于，所述双重RAA-CRISPR/CAS反应体系
5.根据权利要求3所述的双重RAA-CRISPR/CAS反应体系，其特征在于，所述双重RAA-CRISPR/CAS反应体系中，LbCas13a蛋白与Cas13a-crRNA的浓度比为(2-6)：(0.2-0.6)；禽滑液囊支原体RAA上下游引物与Cas13a-ssRNA报告基因的浓度比为(2000～6000)：(1～5)。
6.根据权利要求3～5任一项所述的双重RAA-CRISPR/CAS反应体系，其特征在于，所述双重RAA-CRISPR/CAS反应体系包括：2～10mmol/L dNTP、0.2～1.0μmol/L单链结合蛋白、1.0～2.0μmol/L重组酶蛋白、0.2～1.0U/μL DNA聚合酶、10～50mmol TrisHCl、40～80mmolNaCl、6～10mmol/L二硫苏糖醇、1.0～5.0μmol/L鸡毒支原体RAA上下游引物、1.0～5.0μmol/L禽滑液囊支原体RAA上下游引物、1～2μmol/L Cas12a-crRNA、0.5～1.0μmol/LLbCas12a、0.1～0.5nmol/L Cas12a-ssDNA报告基因、0.2～0.8μmol/LCas13a-crRNA、1～5μmol/L LbCas13a、0.5～1.5nmol/L Cas13a-ssRNA报告基因、0.4～1.0U/μL RNaseInhibitor、0.4～1.0U/μL T7 RNAPolymerase、0.1-1U/μL Exo核酸外切酶。
7.同时检测鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的一管式冻干管，其特征在于，检测鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的反应体系通过冻干被固定在所述一管式冻干管中，所述检测鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的反应体系中含有权利要求3～6任一项所述的双重RAA-CRISPR/CAS反应体系。
8.权利要求7所述一管式冻干管的制备方法，其特征在于，所述冻干的条件包括：将装有所述双重RAA-CRISPR/CAS反应体系的一管式冻干管先于-80℃冷冻1～1.5h再进行设备冻干；所述设备冻干包括：预冻阶段、设备抽真空、冷冻干燥和解析干燥阶段；所述解析干燥阶段的条件为：将隔板温度升至-20～-25℃保持12～16h，然后将隔板温度升至4～8℃并保持0.5～1h，最后将隔板降至20～25℃并保持3～5h。
9.同时检测鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒含有权利要求1所述的RAA引物组合或权利要求2所述的crRNA分子或权利要求3～6任一项所述的双重RAA-CRISPR/CAS反应体系或权利要求7所述的一管式冻干管。
10.非疾病诊断和治疗目的检测鸡毒支原体和/或禽滑液囊支原体的方法，其特征在于，获得待测样品的核酸作为待测核酸，以所述待测核酸为模板，使用权利要求9所述的检测试剂盒，对所述待测核酸进行实时PCR，对所述实时PCR的扩增过程进行监控，在扩增过程中出现扩增曲线，代表待测样品为鸡毒支原体和/或禽滑液囊支原体阳性；
...【技术特征摘要】
1.鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的raa引物组合，其特征在于，包括：扩增鸡毒支原体的raa引物对，其序列如seq id no.1-2所示，和扩增禽滑液囊支原体的raa引物对，其序列如seq id no.4-5所示。
2.基于crispr/cas技术检测鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的crrna分子，其特征在于，所述鸡毒支原体的crrna分子为cas12a-crrna，其序列如seq id no.3所示；所述禽滑液囊支原体的crrna分子为cas13a-crrna，其序列如seq id no.6所示。
3.鸡毒支原体和禽滑液囊支原体的双重raa-crispr/cas反应体系，其特征在于，包括：权利要求1所述的raa引物组合和权利要求2所述的crrna分子；还包括：序列如fam-tttttttt tt-bhq1所示的cas12a-ssdna报告基因，和序列如rox-uuuuuuuu-bhq2所示的cas13a-ssrn a报告基因。
4.根据权利要求3所述的双重raa-crispr/cas反应体系，其特征在于，所述双重raa-crispr/cas反应体系中，lbcas12a蛋白与cas12a-crrna的浓度比为(0.6～1)：(0.8～2)；鸡毒支原体raa上下游引物与cas12a-ssdna报告基因的浓度比为(2000～6000)：(0.1～0.5)。
5.根据权利要求3所述的双重raa-crispr/cas反应体系，其特征在于，所述双重raa-crispr/cas反应体系中，lbcas13a蛋白与cas13a-crrna的浓度比为(2-6)：(0.2-0.6)；禽滑液囊支原体raa上下游引物与cas13a-ssrna报告基因的浓度比为(2000～6000)：(1～5)。
6.根据权利要求3～5任一项所述的双重raa-crispr/cas反应体系，其特征在于，所述双重raa-crispr/cas反应体系包括：2～10mmol/l dntp、0.2～1.0μmol/l单链结合蛋白、1.0～2.0μmol/l重组酶蛋白、0.2～1.0u/μl dna聚合酶、10～50mmol trishcl、40～80mm...
【专利技术属性】
技术研发人员：王新杰，张阿敏，高姗姗，孙晓明，王琴，
申请(专利权)人：北京亿森宝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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