【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物检测，具体地说，涉及一种同时检测禽滑液囊支原体野毒和疫苗的方法、产品及应用。
技术介绍
1、滑液囊支原体(mycoplasma synoviae,ms)感染可引起鸡和火鸡的滑膜炎、腱鞘炎、鸡蛋尖端综合征等症状。与其他病原微生物混合感染后，加剧病原微生物致病力，导致鸡群死淘率上升，肉鸡饲料利用率降低、胴体降级，蛋鸡产蛋量下降、蛋壳质量差等现象，给家禽养殖业造成了极大的经济损失。对于ms感染的防治，主要是种源净化、疫苗免疫和药物治疗三种方式。
2、现有的对禽滑液囊支原体检测的技术方法有：酶联免疫吸附试验(elisa)、间接免疫荧光试验(ifa)、病毒的分离与鉴定、抗原检测技术、环介导等温扩增技术、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)、微滴数字pcr绝对定量检测技术等。
3、酶联免疫吸附试验特异性和灵敏性有待提高，一般只作为诊断的辅助手段，且操作过程不够简便，无法快速获得反应结果。间接免疫荧光试验参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多，准确性有待提高。病毒分离培养检测需在三级及以上生物安全实验室开展，且病毒分离培养具有一定的困难，设备试剂昂贵且存在较大风险。抗原检测技术受自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性，重复性不好，干扰因素较多。pcr检测技术需进行终点检测，开盖进行凝胶电泳，极容易形成气溶胶污染，影响后续检测，且制备凝胶，进行电泳，操作繁琐，时间长，只能定性分析，及判定阴阳，无法进行定量分析，敏感性中等，存在非特异性扩增，当非特异条带
4、因此，仍有必要对禽滑液囊支原体检测技术进行进一步研究。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供一种特异性好，敏感度高的可有效对禽滑液囊支原体野毒和疫苗同时检测的方法。
2、为了实现该目的，本专利技术的技术方案如下：
3、一种非疾病诊断或治疗目的的检测禽滑液囊支原体野毒和疫苗的方法，所述方法采用raa-crispr cas12a/cas13a技术，在同一反应体系中对待测样品核酸进行扩增后，可实现对禽滑液囊支原体野毒和疫苗的检测，所述反应体系包括：禽滑液囊支原体野毒株上、下游引物、禽滑液囊支原体疫苗株上、下游引物、cas12a-crrna和cas13a-crrna；
4、所述禽滑液囊支原体野毒株上、下游引物的序列分别如seq id no.1和2所示，所述禽滑液囊支原体疫苗株上、下游引物的序列分别如seq id no.4和5所示；
5、所述cas12a-crrna的序列如seq id no.3所示，所述cas13a-crrna的序列如seqid no.6所示。
6、crispr是“clustered regμlarly interspaced short palindromic repeats”缩写，指规律成簇的间隔短回文重复。cas是“crispr-associated”缩写，为crispr相关。crispr/cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的二次免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。crispr/cas系统可以识别出外源dna，并将它们切断，沉默外源基因的表达。
7、crispr-cas12a是由张锋团队于2015年开发的新型crispr基因编辑工具。最初名为crispr-cpf1，之后改做crispr-cas12a。crspr-cas12a系统属于typeⅴ型crispr系统。cas12a识别的pam序列为富胸腺嘧啶(t)序列，可以扩展crispr的编辑范围；另外，cas12a切割靶dna产生粘性末端，更加有利于目的基因的插入。
8、本专利技术运用的检测技术为raa-crispr cas12a/cas13a，其是重组酶介导链替换核酸扩增技术，是一种恒温核酸快速扩增技术，利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在常温下，该重组酶可与引物dna紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板dna上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链结合蛋白的帮助下，打开模板dna的双链结构，并在dna聚合酶的作用下，形成新的dna互补链，扩增产物以指数级增长。它是由重组酶、聚合酶和单链结合蛋白以及两条特异性的上下游引物参与的等温扩增。首先，重组酶在辅助因子的作用下与引物结合形成核酸蛋白复合物，然后该复合物寻找与靶标dna的互补区域进行杂交并置换下另一条单链，置换下的单链马上被单链结合蛋白结合防止其再与互补链杂交，最后重组酶在atp的作用下与引物解离，聚合酶与引物结合并沿模板进行延伸。
9、本专利技术将raa技术具体运用到解决禽滑液囊支原体核酸检测上，实现了在同一反应体系中，既可检测禽滑液囊支原体野毒株，又可检测禽滑液囊支原体疫苗株的效果，可对样本中是否含有禽滑液囊支原体野毒或疫苗进行高效判断，大大方便了实际的产业应用。除了可应用于禽滑液囊支原体感染与否，以及疫苗免疫评估的判断中，也可应用于禽滑液囊支原体相关药物效果的评价中，具有广泛的应用价值。
10、在设计引物时本专利技术下载了野毒株和疫苗株全长序列，利用软件比对分析了差异基因序列的特异性，并在全基因组找寻能同时满足3个条件的靶基因位点：1.能同时鉴别野毒株和疫苗株。2.所选的位点保守。3.crrna的设计是crispr-cas12a检测技术的关键步骤之一，因此在所选的序列里特别选择了pam位点。根据crispr-cas13a的检测需求，设计rpa引物时还特别加上一段后续便于的体外转录序列。最终，本专利技术经过深入研究和综合考量，设计获得了可保证在同一个反应体系中检测野毒株和疫苗株时不存在非特异性扩增的特异性检测禽滑液囊支原体野毒和疫苗的引物对及cas12a-crrna、cas13a-crrna组合。
11、本专利技术检测方法中的cas12针对的探针是ssdna，cas13针对探针是ssrna。
12、本专利技术检测方法可对多种样品中的核酸进行检测，包括但不限于，禽类肺、输卵管、咽拭子、气囊。
13、本专利技术的所述反应体系还包括：lbcas12a蛋白、lbcas13a蛋白、ssdna和ssrna；所述ssdna和ssrna分别标记有产生不同荧光色的荧光基团；未标记前的ssdna的序列如seqid no.19所示，未标记前的ssrna的序列为uuuuuuuu，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光猝灭基团；
14、优选，所述荧光报告基团为选自fam、hex、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas中的任一种；所述荧光猝灭基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种非疾病诊断或治疗目的的检测禽滑液囊支原体野毒和疫苗的方法，其特征在于，所述方法采用RAA-CRISPR CAS12a/CAS13a技术，在同一反应体系中对待测样品核酸进行扩增后，可实现对禽滑液囊支原体野毒和疫苗的同时检测，所述反应体系包括：禽滑液囊支原体野毒株上、下游引物、禽滑液囊支原体疫苗株上、下游引物、Cas12a-crRNA和Cas13a-crRNA；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括：LbCas12a蛋白、LbCas13a蛋白、ssDNA和ssRNA；所述ssDNA和ssRNA分别标记有产生不同荧光色的荧光基团；未标记前的ssDNA的序列如SEQ ID No.19所示，未标记前的ssRNA的序列为UUUUUUUU，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光猝灭基团；
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应体系包括：3～14mmol/L dNTP、0.4-1.4μmol/L单链结合蛋白、1.2-2.2μmol/L重组酶蛋白、0.4-1.2U/μl DNA聚合酶、10～50mmol/L TrisHCl、30～90
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，包括：
5.权利要求1-4任一项所述的方法在非疾病诊断或治疗目的的检测禽滑液囊支原体毒株和禽滑液囊支原体疫苗株中的应用。
6.RAA引物组合，其特征在于，包括禽滑液囊支原体野毒株上、下游引物和禽滑液囊支原体疫苗株上、下游引物；所述禽滑液囊支原体野毒株上、下游引物的序列分别如SEQ IDNo.1和2所示，所述禽滑液囊支原体疫苗株上、下游引物的序列分别如SEQ ID No.4和5所示。
7.核酸分子组合，其特征在于，包括Cas12a-crRNA和Cas13a-crRNA；所述Cas12a-crRNA的序列如SEQ ID No.3所示，所述Cas13a-crRNA的序列如SEQ ID No.6所示。
8.权利要求6所述的RAA引物组合或权利要求7所述的核酸分子组合在非疾病诊断或治疗目的的检测禽滑液囊支原体野毒和疫苗中的应用。
9.一管式禽滑液囊支原体野毒和疫苗检测冻干管，其特征在于，包括用于检测禽滑液囊支原体野毒和疫苗的反应体系经冻干后的物质，所述反应体系如权利要求1-3中任一项所述。
10.一种同时检测禽滑液囊支原体野毒和疫苗的试剂盒，其特征在于，包括：基于RAA-CRISPR CAS12a/CAS13a技术的反应体系，或权利要求6所述的RAA引物组合，或权利要求7所述的核酸分子组合，或权利要求9所述的一管式禽滑液囊支原体野毒和疫苗检测冻干管；所述反应体系如权利要求1-3中任一项所述。
...【技术特征摘要】
1.一种非疾病诊断或治疗目的的检测禽滑液囊支原体野毒和疫苗的方法，其特征在于，所述方法采用raa-crispr cas12a/cas13a技术，在同一反应体系中对待测样品核酸进行扩增后，可实现对禽滑液囊支原体野毒和疫苗的同时检测，所述反应体系包括：禽滑液囊支原体野毒株上、下游引物、禽滑液囊支原体疫苗株上、下游引物、cas12a-crrna和cas13a-crrna；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括：lbcas12a蛋白、lbcas13a蛋白、ssdna和ssrna；所述ssdna和ssrna分别标记有产生不同荧光色的荧光基团；未标记前的ssdna的序列如seq id no.19所示，未标记前的ssrna的序列为uuuuuuuu，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光猝灭基团；
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应体系包括：3～14mmol/l dntp、0.4-1.4μmol/l单链结合蛋白、1.2-2.2μmol/l重组酶蛋白、0.4-1.2u/μl dna聚合酶、10～50mmol/l trishcl、30～90mmol/l nacl、6～12mmol/l二硫苏糖醇、1.0～7.0μmol/l禽滑液囊支原体野毒株上游引物、1.0～7.0μmol/l禽滑液囊支原体野毒株下游引物、1.0～7.0μmol/l禽滑液囊支原体疫苗株上游引物、1.0～7.0μmol/l禽滑液囊支原体疫苗株下游引物、1～2μmol/l cas12a-crrna、0.5～1.5μmol/l lbcas12a、10～80nmol/l ssdna、1～7μmol/llbcas13a、0.2～1.0μmol/l cas13a-crrna、10～60nmol...
【专利技术属性】
技术研发人员：高姗姗，孙晓明，王新杰，张阿敏，王琴，
申请(专利权)人：北京亿森宝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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