本发明专利技术公开了一种流行性造血器官坏死病毒（EHNV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、逆转录酶、重组聚合酶和对照品。本发明专利技术的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到6fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。
RAA constant temperature fluorescence detection method and reagent for ehnv
【技术实现步骤摘要】
流行性造血器官坏死病毒(EHNV)的RAA恒温荧光检测方法及试剂
本专利技术属于分子生物学
，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种流行性造血器官坏死病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。
技术介绍
在世界水产养殖业中，病毒所造成的危害一直都是非常巨大的。其中虹彩病毒的危害比较严重，其危害的分布范围比较广泛，并且鱼类一旦同时感染虹彩病毒和寄生虫，致死率可达90％以上。流行性造血器官坏死病毒(EHNV)是虹彩病毒科蛙病毒属的成员，能引起河鲈，虹鳟等多种鱼类的幼鱼和成鱼出现内脏坏死以致死亡。1986年在澳大利亚首次被发现，会感染坏死鱼的肾脏造血组织、肝脏和脾脏，对鱼的致死率可达100％。对于EHNV的防治尚无特效药，病毒的早期检测和诊断仍是最重要的防治手段。对于病害检测这方面使用方法主要有镜检观察，分子检测和免疫学检测。PCR分子检测方法是最为常用的检测方法，其方法敏感、准确、快速而被广泛应用，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场检测和普及使用。本专利技术建立了RAA恒温荧光来检测流行性造血器官坏死病毒的方法，快速方便，准确可靠，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国水产养殖及其产品的贸易有重要作用。重组酶介导扩增(Recombinase-aidAmplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供流行性造血器官坏死病毒(EHNV)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。为实现以上目的，本专利技术采用以下技术方案：一种流行性造血器官坏死病毒(EHNV)核酸的检测试剂盒，包括：流行性造血器官坏死病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述流行性造血器官坏死病毒正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述流行性造血器官坏死病毒反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、流行性造血器官坏死病毒标准品和DEPC处理水中至少一种。在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述的逆转录体系由RTE逆转录酶、RNA酶抑制剂组成。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20％PEG；BBuffer为280mMMgAc。在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μLSSB蛋白、120ng/μLrecA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μLRad51、30ng/μLBsuDNA聚合酶，30ng/mLRTE逆转录酶、100mmol/LTricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，流行性造血器官坏死病毒标准品为含有流行性造血器官坏死病毒保守基因部分序列的阳性质粒。在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述含有流行性造血器官坏死病毒保守区域基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种流行性造血器官坏死病毒的RAA恒温荧光检测方法，提取待测样品的RNA，以待测样品的RNA为模板，在流行性造血器官坏死病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、ABuffer、BBuffer和DEPC处理水存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述流行性造血器官坏死病毒正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述流行性造血器官坏死病毒反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在一些实施方案中，所述的流行性造血器官坏死病毒核酸RNA提取采用传统的Trizol-RNA试剂或者采用等效的RNA提取试剂盒。在一些实施方案中，所述实施荧光RAA反应程序为：37℃，40s；37℃，20min，共计40个循环；本专利技术所述检测方法需要实时荧光RAA反应结束后，利用实时荧光RAA仪分析软件，根据实时荧光RAA的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为待测样本FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为流行性造血器官坏死病毒阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为流行性造血器官坏死病毒阴性结果。有益效果1、快速高效：整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到109-1010个拷贝；2、操作简单：不需要特殊试剂，不需要预先解链等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件比较温和；3、高特异性：本专利技术对鱼类其他的病症SVCV、CYHV2、IHNV、CEV、FBS、VNNV的质粒DNA均不发生扩增。4、高灵敏度：本专利技术的检测极限可以达到6fg/μL反应5、鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，适合现场检测。附图说明图1为本专利技术中涉及的4对引物RAA扩增曲线图。图2为RAA检测方法对EHNV的灵敏度实验图，从左到右依次为6pg/μL、600fg/μL、60fg/μL、6fg/μL、0.6fg/μL的阳性标准品的扩增结果。图3为RAA检测方法对EHNV的特异性实验图。具体实施方法以下通过具体实施例对本专利技术进一步说明，但并不局限于此。实施例1：本专利技术对流行性造血器官坏死病毒在Genebank数据库中搜索流行性造血器官坏死病毒株基因序列，使用DNAMAN6.0软件对多序列进行比对，找出保守的区段。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种流行性造血器官坏死病毒（EHNV）核酸的检测试剂盒，包括：流行性造血器官坏死病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述流行性造血器官坏死病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述流行性造血器官坏死病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。/n
【技术特征摘要】
1.一种流行性造血器官坏死病毒（EHNV）核酸的检测试剂盒，包括：流行性造血器官坏死病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述流行性造血器官坏死病毒正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、所述流行性造血器官坏死病毒反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。
3.根据权利要求1和2所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、流行性造血器官坏死病毒标准品和DEPC处理水中至少一种。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述的逆转录体系由RTE逆转录酶、RNA酶抑制剂组成。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述ABuffer为20%PEG；BBuffer为280mMMgAc。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μLSSB蛋白、120ng/μLrecA重组...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾鹏，钱冬，程奇，温智清，刘荭，张建勋，肖文，余国君，史秀杰，郑晓聪，王津津，于力，何俊强，刘莹，
申请(专利权)人：杭州众测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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