一种合成双端修饰的长单链DNA的方法及所获得的长单链DNA技术

一种合成双端修饰的长单链DNA的方法及所获得的长单链DNA，属于DNA合成技术领域，解决了现有长单链DNA的合成方法存在的成本高、成功率低、无法在单链DNA两端选择性修饰的问题。本发明专利技术的一种合成双端修饰的长单链DNA的方法，包括以下步骤：第一次滚环扩增反应：采用phi29 DNA聚合酶、带有官能团X的短链引物和环状模板合成一端带有官能团X的单链DNA；第二次滚环扩增反应：将上述获得的单链DNA作为引物，采用Therminator DNA聚合酶和带有官能团Y的dN*TPs合成双端带有官能团的长单链DNA。本发明专利技术的合成方法适用于合成长度能够达到500个碱基以上的、只在双端带有修饰基团的单链DNA。

A method for synthesizing two terminal modified long single stranded DNA and obtaining long single chain DNA

A method of synthesizing double end modified long single strand DNA and the long single strand DNA obtained by this method belong to the field of DNA synthesis technology. It solves the problem of high cost, low success rate and unable to be selectively modified at both ends of single chain DNA with the existing method of the existing long single strand DNA. A method for synthesizing double end modified long single strand DNA, including the following steps: first ring amplification reaction: using phi29 DNA polymerase, short chain primers with functional group X and ring templates to synthesize single strand DNA with functional group X at one end; second roll ring amplification reaction: the single strand DNA obtained above is used as an introduction. Therminator, DNA polymerase and dN*TPs with functional group Y were used to synthesize long single strand DNA with functional groups at both ends. The synthetic method of the invention is suitable for synthesizing single stranded DNA with only 500 ends and a modified group at the two ends.

【技术实现步骤摘要】
一种合成双端修饰的长单链DNA的方法及所获得的长单链DNA
本专利技术属于DNA合成
，具体涉及一种合成双端修饰的长单链DNA的方法及所获得的长单链DNA。
技术介绍
核酸的单分子研究具有重要生物学意义，是目前研究热点之一。对单链DNA末端进行选择性修饰，是开展核酸的高级结构及功能的单分子研究的关键。目前，对于较长的单链DNA单分子研究，原料主要来源于从双链熔融裂解成单链得到，操作繁琐；而从工厂高价购买的单链DNA长度限制于300nt以下，且碱基数越多，造价越高，合成失败率越高。现有合成较长的单链DNA(长度在500碱基以上)的方法主要为RCA技术，即滚环扩增技术(rollingcircleamplification)，然而传统RCA技术制备的单链DNA只有5′端能够含有修饰基团。同时，利用特别的酶RCA技术可以引入带有官能团修饰的核苷酸dN*TPs到单链DNA，然而通过这种方法合成的单链DNA官能团位点随机分布，不能够实现在单链DNA两端的选择性修饰，也就不能够实现单链DNA的选择性固定。
技术实现思路
为了解决现有长单链DNA的合成方法存在的成本高、成功率低、无法在单链DNA两端选择性修饰的问题，本专利技术提供一种合成双端修饰的长单链DNA的方法及所获得的长单链DNA。本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术的一种合成双端修饰的长单链DNA的方法，包括以下步骤：步骤一、第一次滚环扩增反应采用phi29DNA聚合酶、带有官能团X的短链引物和环状模板合成一端带有官能团X的单链DNA；步骤二、第二次滚环扩增反应将上述获得的单链DNA作为引物，采用TherminatorDNA聚合酶和带有官能团Y的dN*TPs合成双端带有官能团的长单链DNA。作为优选的实施方式，所述官能团X为：6-FAM、Acrydite、AlexaFluor488、AMCA、Azide(N3)、BHQ1、BHQ2、Biotin、Biotin-TEG、C3Spacer、CHCH、CHO、COOH、Cy3、Cy5、CY5.5、Dabcyl、DBCO、DesthioBiotin、DesthioBiotin-TEG、Dig、Dithiol、5`DualBiotin、Ferrocene、HEX、HS-SHC6、JOE、MethyleneBlue、NH2C12、NH2C6、P、Pyrene、Quasar670、ROX、SHC6、Spacer18、TAMRA、TET、TexasRed、tripleBiotin或tripleSH。作为优选的实施方式，所述短链引物的序列如序列表中的SEQIDNO:2所示。作为优选的实施方式，所述环状模板的序列如序列表中的SEQIDNO:1所示。作为优选的实施方式，所述官能团Y为：Biotin、Fluorescein、TexasRed、Aminoallyl或AlexaFluor。作为优选的实施方式，步骤一的总反应体系包括：去离子水4.5μL，终浓度为1X的phi29DNA聚合酶反应缓冲液1μL，终浓度为25μM的短链引物2.5μL，终浓度为0.1μg/mL的环状模板1μL，终浓度为0.5mM的eachdNTPs0.5μL，终浓度为0.5U/μL的phi29DNA聚合酶0.5μL。作为优选的实施方式，步骤一的具体反应过程如下：将去离子水4.5μL，终浓度为1X的phi29DNA聚合酶反应缓冲液1μL，终浓度为25μM的短链引物2.5μL，终浓度为0.1μg/mL的环状模板1μL在95℃条件下加热3min，0℃条件下冷却15min；向上述所得产物中加入终浓度为0.5mM的eachdNTPs0.5μL和终浓度为0.5U/μL的phi29DNA聚合酶0.5μL，30℃孵育3～12h，使用GenEluteTMPCR回收试剂盒回收单链DNA产物。作为优选的实施方式，步骤二的总反应体系包括：终浓度为10μg/mL的单链DNA产物4μL，终浓度为1X的TherminatorDNA聚合酶反应缓冲液1μL，终浓度为0.1μg/mL的环状模板2μL，终浓度为0.2mM的eachdN*TPs2μL、终浓度为2U/μL的TherminatorDNA聚合酶1μL。作为优选的实施方式，步骤二的具体反应过程如下：将终浓度为10μg/mL的单链DNA产物4μL，终浓度为1X的TherminatorDNA聚合酶反应缓冲液1μL，终浓度为0.1μg/mL的环状模板2μL在95℃条件下加热3min，0℃条件下冷却15min；向上述所得产物中加入终浓度为0.2mM含有dUTP-biotin的eachdN*TPs2μL和终浓度为2U/μL的TherminatorDNA聚合酶1μL，75℃孵育过夜，使用GenEluteTMPCR回收试剂盒回收长单链DNA产物。本专利技术还提供一种采用上述方法合成的长单链DNA。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术的合成方法适用于合成单链长度能够达到500个碱基以上的、只在双端带有修饰基团的长单链DNA。2、本专利技术的合成方法具有操作简单的特点，对于合成条件以及仪器的要求较低，并且能够合成只在双端具有特异性官能团的长单链DNA产物。3、本专利技术创造了一种制备只在两端具有修饰官能团的单链DNA，有助于将单链DNA进行两端固定与中间自由端的研究，简化了单链核酸研究领域研究目标的获取方式。4、本专利技术的合成方法相对于熔融双链DNA的方法步骤简单，合成无需复杂的制备仪器，造价大幅度降低，对于单分子核酸研究领域具有推动作用。附图说明图1为实施例1所得长单链DNA的电泳验证结果。图2为实施例3水流冲刷试验的前后对比图。图2a表示水流冲刷前微球数目，图2b表示水流冲刷后微球数目。图3为实施例3水流冲刷试验的前后对比图。图3a表示水流冲刷前微球数目，图3b表示水流冲刷后微球数目。图4为实施例3水流冲刷试验的前后对比图。图4a表示水流冲刷前微球数目，图4b表示水流冲刷后微球数目。图5为实施例3水流冲刷试验的前后对比图。图5a表示水流冲刷前微球数目，图5b表示水流冲刷后微球数目。图6为流体池的示意图。具体实施方式RCA技术，即滚环扩增技术(rollingcircleamplification)。滚环扩增方法是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物(与部分环状模板互补)，在酶催化下将dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片段。滚环扩增(rollingcircleamplification，RCA)这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力，然而目前的RCA技术只能在一端引入官能团。本专利技术是一种合成双端修饰的长单链DNA的方法，主要包括两步RCA反应，具体是通过以下步骤实现的：首先采用phi29DNA聚合酶、带有官能团X的短链引物和环状模板进行滚环扩增反应合成一端带有官能团X的单链DNA；然后将上述获得的单链DNA作为引物，采用TherminatorDNA聚合酶和带有官能团Y的dN*TPs再次进行滚环扩增反应合成双端带有官能团的长单链DNA。官能团X位于短链引物的5′端；所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种合成双端修饰的长单链DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、第一次滚环扩增反应采用phi29 DNA聚合酶、带有官能团X的短链引物和环状模板合成一端带有官能团X的单链DNA；步骤二、第二次滚环扩增反应将上述获得的单链DNA作为引物，采用Therminator DNA聚合酶和带有官能团Y的dN*TPs合成只在双端带有官能团的长单链DNA。

【技术特征摘要】
1.一种合成双端修饰的长单链DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、第一次滚环扩增反应采用phi29DNA聚合酶、带有官能团X的短链引物和环状模板合成一端带有官能团X的单链DNA；步骤二、第二次滚环扩增反应将上述获得的单链DNA作为引物，采用TherminatorDNA聚合酶和带有官能团Y的dN*TPs合成只在双端带有官能团的长单链DNA。2.根据权利要求1所述的一种合成双端修饰的长单链DNA的方法，其特征在于，所述官能团X为：6-FAM、Acrydite、AlexaFluor488、AMCA、Azide(N3)、BHQ1、BHQ2、Biotin、Biotin-TEG、C3Spacer、CHCH、CHO、COOH、Cy3、Cy5、CY5.5、Dabcyl、DBCO、DesthioBiotin、DesthioBiotin-TEG、Dig、Dithiol、DualBiotin、Ferrocene、HEX、HS-SHC6、JOE、MethyleneBlue、NH2C12、NH2C6、P、Pyrene、Quasar670、ROX、SHC6、Spacer18、TAMRA、TET、TexasRed、tripleBiotin或tripleSH。3.根据权利要求1所述的一种合成双端修饰的长单链DNA的方法，其特征在于，所述短链引物的序列如序列表中的SEQIDNO:2所示。4.根据权利要求1所述的一种合成双端修饰的长单链DNA的方法，其特征在于，所述环状模板的序列如序列表中的SEQIDNO:1所示。5.根据权利要求1所述的一种合成双端修饰的长单链DNA的方法，其特征在于，所述官能团Y为：Biotin、Fluorescein、TexasRed、Aminoallyl或AlexaFluor。6.根据权利要求1所述的一种合成双端修饰的长单链DNA的方法，其特征在于，步骤一的总反应体系包括：去离子水4.5μL，终浓度为1X的phi29DNA聚合酶反应缓冲液1μL，终浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文科，刘建宇，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22