包含核酸组装体的结构切换、核酸消化和扩增的串联反应的生物传感器制造技术

本申请涉及用于检测分析物的生物传感器、各种试剂盒及其使用方法。具体而言，所述生物传感器的操作模式的基础为：分析物与核酸序列的结合触发滚环扩增，并检测扩增产物作为分析物存在的指标。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含核酸组装体的结构切换、核酸消化和扩增的串联反应的生物传感器本申请要求2015年6月22日递交的美国临时专利申请号62/182,711的优先权，以引用的方式将其内容并入本文。
本申请涉及用于检测分析物的生物传感器、各种试剂盒以及其使用方法。具体而言，所述生物传感器包括滚环扩增(RCA)模板，其中分析物的结合触发引物的激活和扩增反应。
技术介绍
DNA扩增是基因组学、分子诊断学、化学生物学和DNA纳米技术中的重要工具。除了聚合酶链式反应[1]，最近，被称为“滚环扩增”(rollingcircleamplication，RCA)的DNA等温扩增技术引起了很大的关注[2,3]。RCA涉及借助具有链置换能力和高合成能力(processivity)的DNA聚合酶(例如φ29DNA聚合酶(φ29DP))在环状DNA模板上延伸DNA引物[4]。这些聚合酶可连续地将新合成的DNA链从环状模板中移出，从而有效地进行多轮复制。RCA的产物是具有数千个重复单位的极长的单链(ss)DNA[2,3]。由于其扩增能力和操作简便性，RCA已成为流行的DNA扩增技术[5-9]。自然界中DNA聚合酶已演化出具有多种功能的引人瞩目的酶。例如，除了其DNA聚合和链置换功能以外[4]，φ29DP能够实施针对ssDNA(而不针对双链DNA)的3'-5'核酸外切消化[10]。已演化出在DNA聚合酶中常见的溶核酸活性(nucleolyticactivity)，以在体内校正DNA的复制[11]。但是，这种性质很少被研究用于体外应用。
技术实现思路
本申请展示了多功能扩增生物传感策略，该策略将滚环扩增(RCA)、用于靶向识别的结构切换(structure-switching)核酸分子以及核酸聚合酶的核酸外切剪切功能和核酸依赖性聚合功能进行独特的整合，其特征在于两双链体三重核酸组装体(two-duplextripartiteassembly)。本申请的生物传感策略能够输出的检测极限比结构切换核酸分子结合其对应分析物的解离常数低几个数量级。因此，本申请包括用于检测分析物的生物传感器，该生物传感器包含核酸组装体，其中，所述核酸组装体包含：(a)环状单链核酸分子，所述环状单链核酸分子为滚环扩增(RCA)的模板；(b)线性的结合分析物的单链核酸分子；以及(c)包含第一核酸序列和第二核酸序列的线性单链核酸分子，所述第一核酸序列为RCA模板的引物，所述第二核酸序列被具有核酸外切酶(exonuclease)活性的核酸聚合酶消化，其中，在不存在所述分析物的情况下，线性单链核酸分子的所述第一核酸序列与所述环状单链核酸分子的一部分结合，并且线性单链核酸分子的所述第二核酸序列与所述结合分析物的单链核酸分子的一部分结合；而在存在所述分析物的情况下，所述线性单链核酸分子的第二核酸序列与所述结合分析物的单链核酸分子的一部分的结合被破坏，使得所述第二核酸序列能被具有核酸外切酶(exonuclease)活性的核酸聚合酶消化。本申请还包括利用本申请的生物传感器的测定方法。在一些实施方式中，所述测定是检测样品中分析物的方法，其中，所述样品疑似包含所述分析物，所述方法包含将所述样品与本申请的生物传感器进行接触，然后监测来自RCA模板的核酸产物的存在，其中所述来自RCA模板的核酸产物的存在表明在所述样品中存在所述分析物。本申请进一步包括包含本申请的生物传感器的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包括所述生物传感器和使用所述生物传感器实施测定的任何其它试剂(例如具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶)。在一些实施方式中，所述试剂盒包括在所述测定中使用所述生物传感器的说明书以及实施所述测定所需的任何对照。所述对照可处于所述生物传感器自身，或者可选地，所述对照在单独的基底上。在一些实施方式中，所述试剂盒包括实施本申请的任何测定方法所需的全部组分。从以下的详细描述中，本申请的其它的特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解的是，虽然详细的描述和具体的实施例说明了本申请的实施方式，但是其仅用以进行说明，而权利要求的范围不应被这些实施方式所限制，而是应该被赋予与说明书整体相一致的最广泛的解释。附图说明现在将参照附图对本申请的实施方式进行更详细地描述，在附图中：图1(A)示出了本申请生物传感器的一个实施方式的示意图，图1(B)-图1(D)示出了对于包含1μM放射性PP1的一种示例性生物传感器，用0.1U/μLφ29DP消化并通过20％dPAGE进行分析，其中(B)表示仅对PP1消化0-60min；(C)表示在0-2.5μMAP1存在下消化30min；(D)表示在1.5μMAP1和0.5mMATP存在下消化。图2示出了对于包含1μM放射性PP1的本申请的一种示例性生物传感器，在如下条件下用0.1U/μLφ29DP消化30min：(A)在0-2.5μMCT1存在的情况下；(B)在1μMCT1、1.5μMAP1、0.5mMATP存在的情况下；以及(C)在1μMCT1、1.5μMAP1、0.5mMGTP存在的情况下。图3示出了对本申请的示例性生物传感器进行的琼脂糖凝胶分析，其中RCA产物(PR)来自不存在ATP(A)或存在ATP(B)的情况下PP1、CT1和AP1的RCA反应。图4示出了：(A)在1μMCT1、1.5μMI-AP2和100nMPDGF存在的情况下用0.1U/μLφ29DP对1μM放射性PP2消化30min；(B)和(C)示出了对于本申请的示例性生物传感器，在不存在100nMPDGF以及存在100nMPDGF下，对含有1μMPP2、1μMCT1和1.5μMI-AP2的各种组合的RCA反应的混合物中的RP进行琼脂糖凝胶分析。图5示出了使用本申请的示例性生物传感器对PDGF进行检测：(A)对含有1μMPP2、1μMCT1、1.5μMI-AP2以及递增浓度的PDGF的RCA反应混合物中的RP进行的琼脂糖凝胶分析；(B)超分支RCA(hyper-branchedRCA，HRCA)的工作原理；(C)借助EvaGreen对HRCA反应进行实时荧光监测，其中展示了如下浓度：0(基线)、1fM(距离x轴的第二条线)、10fM(距离x轴的第三条线)、100fM(距离x轴的第四条线)、1pM(距离x轴的第五条线)、10pM(距离x轴的第六条线)、100pM(距离x轴的第七条线)、1nM(最上面一条线)；以及(D)120min时的荧光读数关于PDGF浓度的函数。图6示出了对于包含5'-FAM标记的AP1的本申请的生物传感器的一个实施方式，在PP1-AP1杂交体中由φ29DP进行核酸消化。各反应在30℃、50μL1×RCA反应缓冲液(含有1μMAP1、0.1U/μLφ29DP和各种浓度的PP1)中进行60min。反应混合物借助20％dPAGE进行分析。图7示出了在示例性生物传感器(PP1-AP1杂交体)中GTP对PP1降解的作用。该实验在30℃下、50μL1×RCA反应缓冲液(含有1μMPP、1.5μMAP1、0.1U/μLφ29DP和0.5mMGTP)中进行30min。反应混合物通过20％dPAGE进行分析。图8示出了(A)用0.1U/μLφ29DP对在0μM-2.5μMCT1存在的情况下的包含1μM放射性I-PP1的本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测分析物的生物传感器，所述生物传感器包含核酸组装体，其中，所述核酸组装体包含：(a)环状单链核酸分子，所述环状单链核酸分子为滚环扩增(RCA)的模板；(b)线性的结合分析物的单链核酸分子；以及(c)包含第一核酸序列和第二核酸序列的线性单链核酸分子，所述第一核酸序列为RCA模板的引物，所述第二核酸序列是被具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶消化的序列，其中，在不存在所述分析物的情况下，所述线性单链核酸分子的所述第一核酸序列与所述环状单链核酸分子的一部分结合，并且所述线性单链核酸分子的所述第二核酸序列与所述结合分析物的单链核酸分子的一部分结合；而在存在所述分析物的情况下，所述线性单链核酸分子的所述第二核酸序列与所述结合分析物的单链核酸分子的一部分的所述结合被破坏，使得所述第二核酸序列能被具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶消化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.22 US 62/182,7111.用于检测分析物的生物传感器，所述生物传感器包含核酸组装体，其中，所述核酸组装体包含：(a)环状单链核酸分子，所述环状单链核酸分子为滚环扩增(RCA)的模板；(b)线性的结合分析物的单链核酸分子；以及(c)包含第一核酸序列和第二核酸序列的线性单链核酸分子，所述第一核酸序列为RCA模板的引物，所述第二核酸序列是被具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶消化的序列，其中，在不存在所述分析物的情况下，所述线性单链核酸分子的所述第一核酸序列与所述环状单链核酸分子的一部分结合，并且所述线性单链核酸分子的所述第二核酸序列与所述结合分析物的单链核酸分子的一部分结合；而在存在所述分析物的情况下，所述线性单链核酸分子的所述第二核酸序列与所述结合分析物的单链核酸分子的一部分的所述结合被破坏，使得所述第二核酸序列能被具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶消化。2.如权利要求1所述的生物传感器，其中，(a)、(b)和(c)独立地选自于DNA分子和RNA分子。3.如权利要求2所述的生物传感器，其中，(a)、(b)和(c)为DNA分子。4.如权利要求2所述的生物传感器，其中，(a)、(b)和(c)为RNA分子。5.如权利要求2所述的生物传感器，其中，(a)、(b)和(c)包含DNA分子和RNA分子的组合。6.如权利要求1所述的生物传感器，其中，所述线性的结合分析物的单链核酸分子选自于核酸适配体、核酸酶和核酸分子的反义序列。7.如权利要求6所述的生物传感器，其中，所述核酸适配体为DNA适配体或RNA适配体。8.如权利要求6所述的生物传感器，其中，所述核酸酶为脱氧核酶或核酶。9.如权利要求6所述的生物传感器，其中，所述核酸分子的反义序列为病毒核酸序列的反义序列或细菌核酸序列的反义序列。10.如权利要求1所述的生物传感器，所述传感器进一步包含核酸聚合酶。11.如权利要求1-10中任一项所述的生物传感器，其中，所述核酸聚合酶为具有3'至5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶或具有3'至5'核酸外切酶活性的RNA聚合酶。12.如权利要求11所述的生物传感器，其中，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶。13.如权利要求11和12所述的生物传感器，其中，所述核酸聚合酶为φ29DP。14.一种检测样品中的分析物的方法，其中，所述样品疑似包含所述分析物，所述方法包括使所述样品与如权利要求1-13中任一项所述的生物传感器接触，并监测所述来自RCA模板的核酸产物的存在，其中，所述来自RC...

【专利技术属性】
技术研发人员：李应福，约翰·布伦南，刘猛，
申请(专利权)人：麦克马斯特大学，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA