核酸扩增和检测测定制造技术

本发明专利技术涉及用于扩增并检测一定量的核酸的方法或试剂盒。本发明专利技术特别涉及在基于流动的测定装置上进行的等温扩增技术。使用光学读取可以在装置上检测扩增的核酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸扩增和检测测定
本专利技术涉及用于扩增并检测一定量的核酸的方法或试剂盒。本专利技术特别与在基于流动的测定装置上进行的等温扩增技术相关。使用光学读取可以在装置上检测扩增的核酸。
技术介绍
在进行基因分析时，由于样品中存在的数量通常太少而无法检测，因此通常存在扩增样品中的拷贝数的需求。这可以使用例如热循环或等温扩增来实现。已开发出允许对少量的DNA或RNA进行检测的PCR和等温碱基扩增方法。但是，该方法可能需要大约90分钟才能生成结果。热循环测定需要用来加热和冷却的硬件以及用来检测扩增产物存在的构件。等温技术包括SDA、LAMP、SMAP、HDA、EXPAR/NEAR、RPA、NASBA、ICAN、SMART。使用在恒定温度下进行反应。通过将样品、引物、具有链置换活性的DNA聚合酶和底物的混合物在恒定温度下的温育，可以一步完成扩增。这些方法通常在15～60分钟内将核酸拷贝扩增109～1010倍。然而，仍需要检测经扩增的物质存在的构件。基于标准PCR的扩增在36个循环(90～120分钟)后，每个反应可以检测1～10种分子。等温扩增可以实现与基于PCR的技术类似的性能。核酸扩增后，核酸测定就需要次级检测技术，如分光光度法或浊度法。然而，这些已知技术存在缺点。荧光检测需要进行标记以发荧光，使得其价格昂贵。试剂SYBRGreen与DNA结合，使其本身致癌；艾姆斯测试(AmesTest)显示它既具有致突变性又具有细胞毒性。此外，SYBRGreen是非特异性的且附着于任何双链DNA，从而增加了背景信号。浊度测量需要昂贵的仪器来提供量化。WO2011/100747描述了使用酶促扩增级联反应的方法。可以通过暴露于靶核酸序列使固定的核酸链成为双链。可以使用选择性切割双链序列的限制性内切核酸酶来切割双链核酸。这种方法存在若干缺点。双链核酸的序列必须含有限制性内切核酸酶的识别位点，因此被分析序列的选择是受限的。此外，双链物质必须在限制性内切核酸酶的存在下形成。不可能简单地将核酸测试样品加入到装置中以引发扩增，这是因为溶液中还需要其他催化试剂。对于待被添加到装置中的基于额外溶液的试剂催化剂的这种需求限制了设备的有用性。使用限制性酶来序列特异性地切割双链样品是有问题的，因为处于序列中任何位置上的识别位点的存在将引起非特异性切割。因此，限制性酶的使用对特定的序列可能没有选择性，这是因为错配序列也可能导致限制性酶切割链。因此应该避免在初始置换步骤中使用限制酶。一种替代的分子检测技术是侧流测定(lateralflowassay)，其中，通过承载物上的抗体的相互作用来鉴别分子。侧流测定是众所周知的且已在多种测定平台(例如，家庭怀孕测试)中使用了数十年。基本的流动测定已经被用于开发临床、兽医、环境、农业、生物防御和食源性病原体筛选应用的大量测定。条测定(stripassay)适应性强，且因为这样可商业化应用于范围广泛的分析物，包括血液蛋白质生物标志物、真菌毒素、病毒和细菌病原体，以及一系列核酸检测产品。然而，这样的测定受限于所需样品的数量。这样的测定不具有扩增系统，因此只有在测试溶液中存在足够量的被检测分子时，测定才起作用。自20世纪80年代推出以来，侧流技术已经成为定点照护和家庭测试的重要工具。它们一般用于检测诸如HcG、感染性疾病和滥用药物等广泛的目标，并且也常见于兽医测试、环境测试，和用于监测与人体生理状况相关的分析物。最初的测试提供了阳性/阴性的结果，但是读取器技术的发展以及材料和试剂的改进已经使得半定量和定量测定成为可能。侧流测定本质上是免疫测定，其已适应于沿着单一轴线进行操作以适合测试条的形式。存在已发展为商业产品的一些技术变型，但它们通常使用相同的基本概念来起作用。该技术基于一系列毛细管床，如多张多孔的纸或聚合物。这些元件中的每一个都具有输送流体(例如，诸如血液、唾液或尿液等体液或其提取物)的能力。典型的侧流测定的测试条通常由以下部件组成：1、样品垫吸附垫，其上施加有测试样品。这起到海绵的作用，并且保留了过量的样品流体。2、结合垫或试剂垫一旦样品垫饱和，流体就迁移到多孔结合垫，其包含对靶分析物特异性的抗体，该抗体与有色颗粒(通常是金纳米颗粒或乳胶微球，但在一些情况下使用荧光标签)缀合。样品流体使基质消散的同时也溶解了颗粒，并且以一个组合输送的运动，样品和缀合物的混合物流过多孔结构。以这种方式，分析物结合至颗粒，同时进一步沿测试条迁移。3、反应膜通常是这样的膜：在该膜上，抗靶分析物的抗体被固定在横跨该膜的条带中，以用作捕获区或测试线(还存在对照区，含有对缀合物抗体特异性的抗体)。反应膜具有已经固定有第三分子的一个或多个区域(条带)。当样品-缀合物的混合物到达这些条带时，分析物已经结合到颗粒上，条带中的第三“捕获”分子与复合物结合。过了一会儿，当越来越多的流体流过了条带时，颗粒积聚且条带区域颜色发生变化。通常存在至少两个条带：一个条带(对照)捕获任意的颗粒并因此表明反应条件和技术运行良好；第二个条带包含特异性捕获分子并仅捕获在其上已固定有分析物分子的那些颗粒。4、引流条(wick)或废液容器另一个吸收垫设计成通过毛细管作用抽取样品穿过反应膜。在通过测试条带之后，流体进入最后的多孔材料，其仅仅起到废物容器的作用。测试条部件通常固定在惰性背衬材料上，可以简单的试纸条形式存在，或者存在于具有样品口和显示捕获和对照区的反应窗的塑料外壳内。测试条的灵敏度受限于测试溶液中材料的数量。在未扩增的情况下，一个靶分析物分子释放一个抗体缀合物。因此，测定的灵敏度受限于样品的浓度和体积。本专利技术涉及一种以侧流形式扩增信号并允许在短时间内检测少量分子的方法。
技术实现思路
本文描述的技术释放了少量分子，该少量分子引起信号扩增，诱导了使信号以接近指数方式扩增的级联或“多米诺效应”。溶液中不需要试剂，仅通过将测试样品施加到装置就可以启动扩增级联。在下面的描述中，术语置换的(displaced)是指在不断裂化学键的情况下导致从表面释放的过程。置换是因靶分析物的存在而引起的自发过程，而不是需要另一种使释放发生的试剂的化学反应。本专利技术的一个方面包括用于检测流体中靶分析物的存在的装置，所述装置包括：i)置换区域，所述置换区域具有第一固定标记，所述第一固定标记可以因所述靶分析物的存在而被置换以产生第一释放标记，其中，所述置换在不断裂化学键的情况下发生；ii)一个或多个信号扩增区域，所述信号扩增区域具有额外的固定标记，所述额外的固定标记可以因所述第一释放标记的存在而被释放以产生可检测标记；和iii)一个或多个检测区域，所述检测区域可以鉴别可检测标记的存在；其中，所述置换区域、所述信号扩增区域和所述检测区域经连接，以便流体可以从所述检测区域流经所述信号扩增区域并进入所述检测区域。本专利技术的一个方面包括用于检测流体中靶分析物的存在的装置，所述装置包括：i)置换区域，所述置换区域具有第一固定标记，所述第一固定标记可以因所述靶分析物的存在而被置换以产生第一释放标记；ii)一个或多个信号扩增区域，所述信号扩增区域具有额外的固定标记，所述额外的固定标记可以因所述第一释放标记的存在而被释放以产生可检测标记；和iii)一个或多个检测区域，所述检测区域可以鉴别所述可检测标记的存在；其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测流体中靶分析物的存在的装置，所述装置包括：i)置换区域，所述置换区域具有第一固定标记，所述第一固定标记能够因所述靶分析物的存在而被置换以产生第一释放标记；其中，所述置换在不断裂化学键的情况下发生；ii)一个或多个信号扩增区域，所述信号扩增区域具有额外的固定标记，所述额外的固定标记能因所述第一释放标记的存在而被释放以产生可检测标记；和iii)一个或多个检测区域，所述检测区域能够鉴别所述可检测标记的存在；其中，所述置换区域、所述信号扩增区域和所述检测区域经连接，以便流体能从所述检测区域流经所述信号扩增区域并进入所述检测区域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.19 GB 1510850.91.一种用于检测流体中靶分析物的存在的装置，所述装置包括：i)置换区域，所述置换区域具有第一固定标记，所述第一固定标记能够因所述靶分析物的存在而被置换以产生第一释放标记；其中，所述置换在不断裂化学键的情况下发生；ii)一个或多个信号扩增区域，所述信号扩增区域具有额外的固定标记，所述额外的固定标记能因所述第一释放标记的存在而被释放以产生可检测标记；和iii)一个或多个检测区域，所述检测区域能够鉴别所述可检测标记的存在；其中，所述置换区域、所述信号扩增区域和所述检测区域经连接，以便流体能从所述检测区域流经所述信号扩增区域并进入所述检测区域。2.根据权利要求1所述的装置，其中，所述靶分析物是核酸。3.根据权利要求2所述的装置，其中，所述第一固定标记是部分双链的核酸。4.根据权利要求1～3中任一项所述的装置，其中，所述装置包括三个或更多的信号扩增区域。5.根据权利要求1～4中任一项所述的装置，其中，所述第一释放标记包括酶。6.根据权利要求5所述的装置，其中，所述酶使所述可检测标记释放。7.根据权利要求1～6中任一项所述的装置，其中，所述可检测标记包括酶。8.根据权利要求1～6...

【专利技术属性】
技术研发人员：古斯塔沃·安德烈·切尔达莫亚，
申请(专利权)人：剑桥分子诊断有限责任公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB