一种基于铬的功能核酸的传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了金属离子检测技术领域的一种基于铬的功能核酸的传感器及其应用。该传感器包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，所述分子识别元件包括铬离子脱氧核酶，铬离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系和氯高铁血红素，等温扩增体系包括扩增模板；所述信号转换元件包括显色剂。该传感器基于铬离子脱氧核酶、等温指数放大反应和G‑四链体液相传感技术，在检测铬离子中简便快速、灵敏度高、特异性高、耐高盐，并可用于环境中铬离子的现场检测。

A chromium based functional nucleic acid sensor and its application

The invention discloses a chromium based functional nucleic acid sensor and its application in the field of metal ion detection technology. The sensor includes a molecular recognition element, a signal amplification element, and a signal conversion element. The molecular recognition element consists of a chromium deoxy ribozyme, a chromium ion deoxy ribozyme composed of a substrate chain and an enzyme chain. The signal amplification element includes an isothermal amplification system and a chloro hemin, and the isothermal amplification system includes a template for amplification. The signal conversion element includes a chromogenic agent. The sensor is based on chromium ion deoxy ribozyme, isothermal exponential amplification reaction and G four chain body liquid phase sensing technology. It is simple, rapid, high sensitivity, high specificity and high salt resistance in the detection of chromium ions, and can be used in the field detection of chromium ions in the environment.

【技术实现步骤摘要】
一种基于铬的功能核酸的传感器及其应用
本专利技术属于金属离子检测
，具体涉及一种基于铬的功能核酸的传感器及其应用。
技术介绍
铬是VIB族元素，既是必需元素，又是有害元素，其价态起决定性作用。铬在地壳中的平均含量为0.010％～0.011％，分布极不均匀，我国的铬资源不丰富，工业上主要用于制造各种优质合金，也广泛应用于皮革、印染、电镀等工业，一般以离子形式排入环境中。铬是人体不可缺少的微量元素之一。成人每天约需500-700微克铬，而在一般饮食中每天仅能提供50-100微克。当铬缺乏时，易使人体患糖尿病，冠状动脉粥样硬化病，影响到体内脂肪代谢。但是，过多的铬也会产生污染。当空气中铬酸的浓度达0.15-0.31毫克/立方米时，会使人发生鼻中隔穿孔。如果过多地摄入铬，会使人铬中毒，致畸胎和致突变，对人体皮肤、呼吸道和消化系统都会产生较大危害。铬污染还会对地面水生物产生不良影响，也会在植物和鱼类骨骼中产生积累，从而影响到人类的食物链。铬有多种价态，最常见的是三价铬和六价铬。铬的不同化学形态导致不同的环境毒害和生物效应，对人体健康有不同的影响。铬离子中六价铬的毒性更是三价铬的一百多倍，为剧毒致癌物质。肠道对三价铬的吸收仅为1％左右，而对六价铬的吸收是三价铬的3～5倍。六价铬在胃中可被胃酸还原为三价铬，六价铬一旦进入血液中也会马上还原为三价铬。另外，与生物大分子结合后的铬，例如酵母中存在的铬，肠道吸收率高达25％。吸收入血液中的铬是与白蛋白结合而存在的。铬的毒性主要是由六价铬所致，六价铬主要来源于工业生产，职业性铬中毒是由六价铬化合物所致，如重铬酸钾对皮肤有刺激和致敏作用，对肝和肾都有毒性，对婴幼儿可发生中枢神经系统症状。铬酸盐烟和铬酸对呼吸道有明显的损害。有研究指出，六价铬化合物的主要毒性是由六价铬在细胞内还原为三价铬的过程中的产物所引起。如果人体吸入或长时间接触六价铬，会发生肾功能衰竭、头痛、流鼻血、肝衰竭或其他器官衰竭，极易发生癌症。六价铬还会进入DNA遗传给下一代，因此各类产品中微量的六价铬的成因、检测与防治是当今中外皮革界关注的焦点之一。现今常用检验六价铬离子的方法是IUC-18标准方法。该法容易受到颜色的干扰。在检测产品六价铬离子的含量时，往往会由于诸如染料本身颜色的干扰，而使检测限量的确切值无法给出，3mg/kg的参考值也很难达到，另外光谱法，包括原子(吸收、发射、荧光等)光谱、分光光度法等，电化学、声学等方法也有应用。但这些方法依赖于大型仪器和专人操作，在现场和野外检测中受到限制，检测的可靠性和实用性不高，因此迫切需要发展无污染的、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法来满足微量铬金属的检测。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提出一种基于铬的功能核酸的传感器及其应用。具体技术方案如下：本专利技术提供的一种基于铬的功能核酸的传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，所述分子识别元件包括铬离子脱氧核酶；所述铬离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系和氯高铁血红素，所述等温扩增体系包括扩增模板；所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT；所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCCCCCCCAATTTCGCCATCTTCC；所述信号转换元件包括显色剂。所述等温扩增体系包括A体系和B体系；所述A体系包括：扩增模板、dNTPs和铬离子脱氧核酶切割产物；所述B体系包括：BstDNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。所述BstDNA聚合酶反应缓冲液：20mMTris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mMKCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH8.8；所述Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲液：100mMNaCl,50mMTris-HCl,10mMMgCl2,300μg/ml海藻糖，pH7.9。所述信号转换元件还包括终止剂，优选的，所述终止剂为硫酸；所述显色剂为TMB显色剂。一种检测铬离子的方法，包括如下步骤：制备铬离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度(OD值)关系的标准曲线；按上述制备标准曲线的过程检测待测样品的G-四链体功能核酸显色光密度值，通过上述标准曲线计算铬离子的浓度；其中，制备标准曲线的步骤包括：(1)在铬离子脱氧核酶的底物链和酶链中加入不同浓度铬离子溶液，制备铬离子脱氧核酶切割产物；所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT；(2)将扩增模板，dNTPs，铬离子脱氧核酶切割产物和超纯水混合均匀，制备A体系；将BstDNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶和切刻内切酶的反应缓冲溶液混合均匀，制备B体系；所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCCCCCCCAATTTCGCCATCTTCC；(3)A体系先进行孵育，然后与B体系迅速进行混合，孵育扩增，终止反应后得到扩增产物；(4)将扩增产物、酶活缓冲液和氯高铁血红素稀释溶液混匀并反应，形成G-四链体结构；(5)向步骤(4)混合液中加入显色液，混匀并反应，反应结束后加入H2SO4，测定OD450值，得到OD450值随铬离子浓度变化的标准曲线。步骤(1)的操作为：将铬离子脱氧核酶底物链和酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃；加入待测铬离子溶液，25℃孵育6min，加入终止液，得到铬离子脱氧核酶切割产物。步骤(3)的操作为：A体系于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应。步骤(4)中反应温度为37℃，反应时间为30min；步骤(5)中反应温度为37℃，反应时间为10min。一种检测铬离子的试剂盒，包括铬离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显示体系；所述铬离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、铬离子标准溶液和终止液；所述等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、BstDNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和切刻内切酶反应缓冲溶液；所述显示体系包括：氯高铁血红素、酶活缓冲液、TMB显色剂和2MH2SO4；所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT；所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCACACCCACCCACA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于铬的功能核酸的传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其特征在于，所述分子识别元件包括铬离子脱氧核酶；所述铬离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系和氯高铁血红素，所述等温扩增体系包括扩增模板；所述脱氧核酶底物链的序列(5’‑3’)为：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；所述脱氧核酶酶链的序列(5’‑3’)为：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT；所述扩增模板的序列(5’‑3’)为：CCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCCCCCCCAATTTCGCCATCTTCC；所述信号转换元件包括显色剂。

【技术特征摘要】
1.一种基于铬的功能核酸的传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其特征在于，所述分子识别元件包括铬离子脱氧核酶；所述铬离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系和氯高铁血红素，所述等温扩增体系包括扩增模板；所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT；所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCCCCCCCAATTTCGCCATCTTCC；所述信号转换元件包括显色剂。2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述等温扩增体系包括A体系和B体系；所述A体系包括：扩增模板、dNTPs和铬离子脱氧核酶切割产物；所述B体系包括：BstDNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。3.根据权利要求1或2所述的传感器，其特征在于，所述信号转换元件还包括终止剂，优选的，所述终止剂为硫酸；所述显色剂为TMB显色剂。4.一种检测铬离子的方法，其特征在于，包括如下步骤：制备铬离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线；按上述制备标准曲线的过程测定待测样品的G-四链体功能核酸显色光密度值，通过上述标准曲线计算铬离子的浓度；其中，制备标准曲线的步骤包括：(1)在铬离子脱氧核酶的底物链和酶链中加入不同浓度铬离子溶液，制备铬离子脱氧核酶切割产物；所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GTCACGAGTCACTATrAGGAAGATGGCGAAATTGGGGGG；所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CAGTGCTCAGTGATATTGCTCATTTTTGAGCGTGGGTGGAAACTGGATACCGCTTT；(2)将扩增模板，dNTPs，铬离子脱氧核酶切割产物和超纯水混合均匀，制备A体系；将BstDNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶和切刻内切酶的反应缓冲溶液混合均匀，制备B体系；所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCACACCCACCCACAATGACCCACAACTGACTCCCCCCCAATTTCGCCATCTTCC；(3)A体系先进行孵育，然后与B体系迅速进行混合，孵育扩增，终止反应后得到扩增产物；(4)将扩增产物、酶活缓冲液和氯高铁血红素稀释溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗云波，许文涛，黄昆仑，田晶晶，杜再慧，肖冰，董凯，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11