一种分子信标介导的等温扩增检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种由分子信标介导并结合核酸层析检测技术的等温扩增检测方法及其应用。该方法能用于检测多种生物流体介质中的病原体基因组，如血小板中多种未知的污染菌或经输血传播的微小巴贝西虫。本发明专利技术将分子信标介导的等温扩增产物用核酸层析方法进行检测，增强了等温扩增技术向即时检验(快速床旁诊断技术，Point‑Of‑Care Technology，POCT)方向转化开发的可能，并可进一步制成试剂盒，将在应急/战伤紧急救治、检验检疫、突发性传染病的检测与监控、现场快速检测(POCT)等领域获得广泛应用，应用前景广阔。

A molecular beacon mediated isothermal amplification assay and its application

The invention discloses an isothermal amplification detection method and its application, which are mediated by molecular beacons and combined with nucleic acid chromatography detection technology. This method can be used to detect the genomes of pathogens in a variety of biological fluids, such as a variety of unknown contaminant bacteria in platelets or tiny BABEI worms transmitted through blood transfusion. The invention uses the nucleic acid chromatography to detect the isothermal amplification products mediated by the molecular beacon, and enhances the possibility of the isothermal amplification technology to the immediate test (rapid bedside diagnosis technology, Point Of Care Technology, POCT), and can be further made into a kit for emergency / combat emergency treatment and inspection. Quarantine, detection and monitoring of sudden infectious diseases, rapid field detection (POCT) and other fields have been widely applied and have wide application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种分子信标介导的等温扩增检测方法及其应用
本专利技术属于分子检测
，特别是涉及一种由分子信标介导并结合核酸层析检测技术的等温扩增检测方法及其在即时检验中的应用。
技术介绍
顺应临床检验向高精度分析方向发展的趋势，分子诊断作为具有最高技术含量的体外诊断方法，在全球范围内发展迅猛，仅2015年世界分子诊断市场规模估值就近60亿元。分子诊断是指应用分子生物学方法检测体内遗传物质结构或表达水平变化的诊断技术，其核心是基因诊断。分子诊断的常规技术包括聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction，PCR)、DNA测序、单核苷酸多态性(SNP)、基因芯片技术等。血清学检验依赖于人体免疫反应的发生，在传染病的临床检验与诊断中，考虑窗口期及免疫功能不正常人群的存在，从某种意义上说，分子诊断是对免疫诊断的升级与补充。然而，分子诊断的临床实施与应用受到了诸多条件的限制，比如对操作人员及环境要求高，对仪器设备的高度依赖，在产品的技术层面和质量规范管理上也存在困难等。近年来，在临床检验中，即时检验(point-of-caretesting，POCT)理念快速兴起，从简单的干化学技术到传感及生物芯片，其检测项目几乎覆盖了所有医学检验领域。笔者认为，分子生物学技术在POCT领域的应用，特别是分子诊断相关技术与产品的POCT化，不仅会对未来POCT的发展起到极大的推动作用，也会带动分子诊断技术的临床推广与应用。常规PCR技术因对仪器的依赖性高和扩增时间长等问题已不能满足快速、精准基因诊断的需求。在PCR技术基础上发展起来的等温扩增技术，其特点是整个扩增反应(除杂交步骤外)在同一温度下进行，不需要进行PCR反应中的多循环变性、退火、延伸等步骤。已有的等温扩增技术主要包括链置换等温扩增(stranddisplacementamplification，SDA)、滚环等温扩增(rollingcircleamplification，RCA)、核酸序列扩增技术(nucleicacidsequencebasedamplification，NASBA)、环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)、交叉引物介导的等温扩增(Cross-PrimingAmplification，CPA)等。上述等温扩增技术大大降低了核酸扩增对仪器的依赖性，而且在去除反复变温的时间间隔后，扩增所需时间也大大缩短。其中，环介导等温扩增技术(LAMP)因灵敏度高、特异性强、快速高效、技术相对成熟，应用最为广泛，已有相关的技术产品。但是，LAMP扩增产物由系列大小不一的梯度DNA组成，其市售试剂盒的结果判读依赖于产生的焦磷酸镁沉淀，需配备浊度仪进行检测。等温扩增技术若能与简便快速的结果判读方式相结合，更能满足床旁检验或即时检验的需求。
技术实现思路
为解决常规的核酸等温扩增技术结果判读困难、实施受限的问题，本专利技术的第一个目的是提供一种由分子信标(molecularbeacon)介导并结合核酸层析检测技术的等温扩增检测方法。本专利技术所提供的等温扩增检测方法，是在具有茎环结构的DNA即分子信标(molecularbeacon)的介导下，用引物对处于解离状态的基因(DNA)片段进行等温扩增，分子信标具有显色底物A标记，引物具有显色底物B标记，从而可使扩增产物的一端带有显色底物A标签，另一端带有显色底物B标签，扩增产物可在具有分别标记显色反应物A和显色反应物B的两条有色颗粒条带的核酸层析试纸条上发生显色反应，实现对等温扩增结果进行核酸层析检测的方法。所述显色底物A优选为生物素，显色反应物A优选为亲和素，所述显色底物B优选为Fitc，显色反应物B优选为Fitc抗体。除用生物素/亲和素及Fitc/Fitc抗体对扩增产物进行标记和检测外，还可用其它如地高辛/地高辛抗体或荧光染料/荧光染料抗体等可发生显色反应的物质(显色底物/显色反应物)对扩增产物进行标记和检测，所述荧光染料包括Fitc、Cy3、Cy5、AlexaFluor、Rhodamine、FAM等。本专利技术所提供的等温扩增检测方法，可包括以下步骤：第一步，在待测物基因组中的保守区域中寻找目的序列(Target)，根据目的序列的互补序列构建具有茎环结构的分子信标(molecularbeacon)，其中环结构对应的环序列是目的序列的互补序列；将分子信标的茎端头进行显色底物A标记，再根据分子信标中的茎杆对应的茎序列设计用于恒温扩增的引物序列(Primer)，将引物进行显色底物B标记；第二步，以待测样品的基因组DNA为模板，在分子信标的介导下，用引物进行等温扩增，加热变性会使分子信标中互补配对的茎环双链解开，分子信标从发夹状变成链状，环序列与模板互补配对，与茎序列互补的引物会在聚合酶的作用下将模板序列替换下来，形成待检测的靶双链序列扩增产物，扩增产物的一端带有显色底物A标签，另一端带有显色底物B标签；第三步，用具有分别标记显色反应物A和显色反应物B的有色颗粒条带的核酸层析试纸条对扩增产物进行核酸层析检测，标记显色反应物A的有色颗粒条带用于检测分子信标或扩增产物的显色底物A标签，标记显色反应物B的有色颗粒条带用于检测扩增产物的显色底物B标签，根据显色反应结果进行结果判读，若出现两条显色带(显色底物A/显色反应物A条带和显色底物B/显色反应物B条带)说明待测样品中含有目的基因(结果阳性)，若只出现一条显色带(显色底物A/显色反应物A条带)说明待测样品中不含目的基因(结果阴性)。在上述等温扩增检测方法中，所述第一步，针对检测物(如某种病原体等)基因组DNA的茎环结构的分子信标的序列设计中，目的序列一般根据检测物基因组DNA的16SrDNA保守区域或不同检测物基因组DNA的共同序列中与其它几个序列不同的部分进行选择，分子信标中环结构的长度为15-30个核苷酸，环序列可与目的序列互补配对，茎杆的长度为8-12个核苷酸，茎杆的GC含量为40％-60％或70％-80％，是与目的序列无关的3’端和5’端头尾互补配对序列，在空间结构上分子信标呈发夹型。所述分子信标也属于本
技术实现思路
。所述显色底物A优选为生物素，显色反应物A优选为亲和素，所述显色底物B优选为Fitc，显色反应物B优选为Fitc抗体。还可用其它如地高辛/地高辛抗体或荧光染料/荧光染料抗体等可发生显色反应的物质(显色底物/显色反应物)对扩增产物进行标记和检测，所述荧光染料包括Fitc、Cy3、Cy5、AlexaFluor、Rhodamine、FAM等。所述第二步，可对由分子信标介导的等温扩增的反应体系(包括Mg离子浓度等)及反应条件(包括反应温度、反应时间等)进行验证和优化，寻找扩增效率高的最佳反应体系和反应条件，以提升检测的灵敏度和特异性。在分子信标介导的等温扩增的反应体系中，先配置扩增缓冲液(包含DTT、MgCl2、dNTPs等)，然后加入模板、引物及聚合酶等，构成完整的反应体系，优选的20μL反应体系包括：模板1μL，分子信标1μL，引物(20nM)1μL，Tris·HCl(250mM)4μL，DTT(20mM)1μL，MgCl2(100mM)1μL，dNTPs(1mM)1μL，NEBuffer22μL，双蒸水4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由分子信标介导并结合核酸层析检测技术的等温扩增检测方法，在具有茎环结构的DNA即分子信标的介导下，用引物对目的基因(DNA)片段进行等温扩增，所述分子信标具有显色底物A标记，所述引物具有显色底物B标记；用具有分别标记显色反应物A和显色反应物B的有色颗粒条带的核酸层析试纸条对扩增产物进行核酸层析检测，依据对显色条带的判读得到检测结果。

【技术特征摘要】
1.一种由分子信标介导并结合核酸层析检测技术的等温扩增检测方法，在具有茎环结构的DNA即分子信标的介导下，用引物对目的基因(DNA)片段进行等温扩增，所述分子信标具有显色底物A标记，所述引物具有显色底物B标记；用具有分别标记显色反应物A和显色反应物B的有色颗粒条带的核酸层析试纸条对扩增产物进行核酸层析检测，依据对显色条带的判读得到检测结果。2.根据权利要求1所述的等温扩增检测方法，其特征在于：所述显色底物A为生物素，显色反应物A为亲和素，所述显色底物B为Fitc，显色反应物B为Fitc抗体。3.根据权利要求2所述的等温扩增检测方法，其特征在于：除用生物素/亲和素及Fitc/Fitc抗体对扩增产物进行标记和检测外，还可用其它如地高辛/地高辛抗体或荧光染料/荧光染料抗体等可发生显色反应的物质(显色底物/显色反应物)对扩增产物进行标记和检测，所述荧光染料包括Fitc、Cy3、Cy5、AlexaFluor、Rhodamine、FAM等。4.根据权利要求1-3任一所述的等温扩增检测方法，其特征在于：所述等温扩增检测方法，包括以下步骤：第一步，确定待测样品目的基因的靶序列(目的序列)，根据目的序列构建具有茎环结构的分子信标序列，使分子信标序列中环序列是目的序列的互补序列，并将分子信标的茎端头用显色底物A标记；根据分子信标序列中的茎序列设计用于恒温扩增的引物序列，并将引物进行显色底物B标记；第二步，以待测样品的基因组DNA为模板，在分子信标的介导下，用引物进行等温扩增，得到扩增产物；第三步，用所述核酸层析试纸条对扩增产物进行核酸层析检测，根据试纸条上的显色条带进行判读：若出现两条显色带(显色底物A/显色反应物A条带和显色底物B/显色反应物B条带)判定为阳性，说明待测样品中含有目的基因，若只出现一条显色带(显色底物A/显色反应物A条带)判定为阴性，说明待测样品中不含目的基因。5.根据权利要求4所述的等温扩增检测方法，其特征在于：所述第一步，在待测样品基因组中的保守区域中(例如病原体的16SrDNA保守区域或不同病原体基因组DNA的共同序列中与其它几个序列不同的部分)寻找并确定目的序列。6.根据权利要求4或5所述的等温扩增检测方法，其特征在于：所述第二步，20μL反应体系包括：模板1μL，分子信标1μL，引物(20nM)1μL，Tris·HCl(250mM)4μL，DTT(20mM)1μL，MgCl2(100mM)1μL，dNTPs(1mM)1μL，NEBuffer22μL，双蒸水4.2μL，BSA(10mg/mL)2μL，DMSO(1.2μL)，Klenow聚合酶(5000U/mL)0.6μL；反应条件为：先将分子信标和模板混合，置于水浴锅中95℃或直接煮沸5min进行变性，变性结束后自然冷却至室温，将分子信标及和模板的混合物加入到含有反应液的EP管中，然后加入引物，最后加入Klenow聚合酶，用移液枪吹打混匀，将EP管放入到恒温装置中在温度为37℃-45℃范围内进行扩增，扩增时间一般为30分钟，也可适当延长至40-90分钟。7.根据权利要求4或5或6所述的等温扩增检测方法，其特征在于：所述第三步，对等温扩增结果进行结果判读的有色颗粒标记的核酸层析检测试纸条，其有色颗粒可为胶体金颗粒、稀土...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹林盛，王小慧，蔡瑞英，周欠欠，张玉龙，王政军，何楚琳，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11