一种检测2型猪链球菌的RPA方法、其专用引物和探针及用途技术

本发明专利技术提供了用于检测2型猪链球菌的RPA检测方法，其专用引物、探针及其在2型猪链球菌检测中的用途。所述检测方法、其专用引物和探针是基于2型猪链球菌cps2J保守序列设计，具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示寡核苷酸序列。本发明专利技术首次将新型恒温扩增技术RPA应用于2型猪链球菌的检测中，该方法模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合，包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，对DNA模板进行扩增，在37℃的恒温下实现特定核酸序列扩增，扩增产物通过侧向层析试纸条实现可视化判别。本发明专利技术建立的检测方法灵敏度高，检测限可达102拷贝/反应；特异性强，与其他病原体无交叉反应；对硬件设备的要求低，且反应时间仅需15 min；无需对样品进行复杂处理。

A RPA method for detection of Streptococcus suis type 2, its specific primers, probes and uses

The invention provides a RPA detection method for detecting type 2 Streptococcus suis, a special primer, a probe and a use in the detection of type 2 Streptococcus suis. The detection method, its special primers and probes are based on the conserved sequence of Streptococcus suis type 2 cps2J and have the oligonucleotide sequences shown in SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 and SEQ ID NO.4. The method simulates the enzyme reaction process of DNA replication in vivo and amplifies DNA templates by specific combinations of enzymes and proteins, including recombinant enzymes, single-stranded binding proteins and DNA polymerases, to achieve specific nucleic acid sequences at 37 C. The amplified products were visualized by lateral chromatography. The method has the advantages of high sensitivity, detection limit up to 102 copies/reactions, strong specificity, no cross-reactions with other pathogens, low hardware requirements and reaction time of only 15 minutes, and no complicated sample treatment.

【技术实现步骤摘要】
一种检测2型猪链球菌的RPA方法、其专用引物和探针及用途
本专利技术属于生物
，涉及2型猪链球菌的分子生物学，涉及一种检测2型猪链球菌的方法及其用途，特别涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增（RPA）技术快速检测2型猪链球菌的方法、其专用引物和探针及其用途。
技术介绍
猪链球菌（Streptococcussuis，S.suis），属芽孢杆菌纲乳杆菌目链球菌科链球菌属。猪链球菌是一种人畜共患病原体，可导致猪的脑膜炎、关节炎和败血症等，亦引起人类的感染，导致脑膜炎及中毒性休克综合征等，我国于1991年在广东省首次证实猪链球菌病的存在，并于1998年及2005年分别在江苏和四川暴发大规模2型猪链球菌流行感染猪和人的公共卫生事件，在我国南方各省每年都有散发病例出现，给从业人员的生命健康带来严重威胁，同时也造成巨大的经济损失。猪链球菌病潜伏期短，平均2-3天，最短仅数小时，最长7天，病人感染后，临床症状主要有畏寒、突发高热、头昏、全身不适、乏力，伴有头痛及腹泻等胃肠道症状，重症患者迅速发展为中毒性休克综合征，皮肤出现瘀点，四肢及头面部出现瘀斑，部分患者同时伴有脑膜炎、败血症等并发症，严重者可导致休克，甚至死亡。目前临床主要通过标本纯培养后经形态学、生化反应和PCR法检测猪链球菌特异性毒力基因进行鉴定。该法需要特定的设备、耗时、需对样品进行复杂处理，一旦发生疫情，无法快速、准确地进行检测，故建立一种简单、快速、适合现场应用的猪链球菌的检测方法具有重要意义。近年来，恒温核酸扩增技术得到了快速发展，其中重组酶聚合酶恒温扩增（RecombinasePolymeraseAmplification，RPA）技术被誉为是可替代PCR的核酸检测技术，该技术基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合（重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶）对DNA模板进行扩增，可在25-43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。
技术实现思路
本专利技术检测2型猪链球菌的RPA方法，所要解决的技术问题是提供一组用于快速检测2型猪链球菌的特异性引物和探针，以及一种快速、简便、特异性好的2型猪链球菌的检测方法。因此本专利技术检测2型猪链球菌的RPA方法，第一个目的是提供用于检测2型猪链球菌的引物，包括正向引物和反向引物，共两条。所述引物是根据2型猪链球菌荚膜多糖（cps2J）基因设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了2型猪链球菌cps2J基因的保守区，此区域为2型猪链球菌基因组（GenBank：CP000407.1）位于第563057至564055核苷酸位点的一段序列，含有999个碱基的核苷酸片段，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。从SEQIDNO.1序列内筛选设计特异性引物。筛选的特异性引物包括正向引物F3和反向引物R1，分别位于基因组第563201至563230核苷酸位点和第563473至563502核苷酸位点，分别具有如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的寡核苷酸序列，引物的长度为30bp左右，其中反向引物5’端标记生物素（Biotin）。正向引物和反向引物扩增完成后获得的双链DNA将标记有生物素。SEQIDNO.1：ATGGAAAAAGTCAGCATTATTGTACCTATTTTTAATACGGAAAAGTACTTAAGAGAGTGTTTAGATAGCATTATTTCCCAATCGTATACTAATCTAGAGATTCTTTTGATAGATGACGGTTCTTCAGATTCATCAACGGATATATGTTTGGAATACGCAGAGCAAGATGGTAGAATAAAACTTTTCCGGTTACCAAATGGTGGTGTTTCAAACGCAAGGAATTACGGTATCAAAAATAGCACAGCAAATTATATTATGTTTGTAGATTCTGATGATATTGTTGACGGCAACATTGTTGAGTCCTTATACACCTGTTTAAAAGAGAATGATAGTGATTTGTCGGGAGGGTTACTTGCTACTTTTGATGGAAATTATCAAGAATCTGAGCTGCAAAAGTGTCAAATTGATTTGGAAGAGATAAAAGAGGTGCGAGACTTAGGAAATGAAAATTTTCCAAATCATTATATGAGCGGTATCTTTAATAGCCCTTGTTGCAAACTTTATAAGAATATATATATAAACAAAGGTTTTGACACTGAACAGTGGTTAGGAGAGGACTTATTATTTAATCTAAATTATTTAAAGAATATAAAAAAAGTCAGCTATGTAAACAGAAATCTTTATTTTGCTAGAAGAGGTATACAAAGTACTACAAATACGTTTAAAAAAGATGTTTTTATTCAATTAGAAAATTTAGAAGAAAAAACTTTTGATTTGTTTGTTAAAATATTTGGTGGACAATATGAATTTTCTGTTTTTAAAGAGACGCTACAGTGGCATATTATTTATTATAGCTTATTAATGTTCAAAAATGGAGATGAATCGCTTCCAAAGAAATTGCATATATTTAAGTATTTATACAATAGGCATTCTTTAGATACTCTAAGTATTAAACGAACGTCCTCTGTTTTTAAAAGAATATGTAAATTAATTGTTGCTAATAATTTGTTTAAAATTTTTTTAAATACTTTAATTAGGGAAGAAAAAAATAATGATTAASEQIDNO.2：5’ATGTTTGGAATACGCAGAGCAAGATGGTAG3’SEQIDNO.3：5’CATTTCCTAAGTCTCGCACCTCTTTTATCT3’本专利技术检测2型猪链球菌的RPA方法，第二个目的是提供用于检测2型猪链球菌的探针。所述探针是根据2型猪链球菌cps2J基因设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了2型猪链球菌cps2J基因的保守区，此区域含有999个碱基的核苷酸片段，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。从SEQIDNO.1序列内筛选设计特异性探针，设计探针位于基因组第563379至563424核苷酸位点，具有SEQIDNO.4所示的寡核苷酸序列，，且5’端标记荧光素FAM，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），将第31位碱基替换为一个四氢呋喃（THF）。SEQIDNO.4：5’GAGAATGATAGTGATTTGTCGGGAGGGTTACTTGCTACTTTTGATG3’所述探针的长度为45bp，其中5’端30bp，3’端15bp。所述探针由荧光素（羧基荧光素FAM）、5’端序列、四氢呋喃（THF）、3’端序列及3’端延伸阻断基团（磷酸基团）组成。所述探针与扩增后的标记有生物素的DNA退火，RPA系统中的nfo酶将在THF部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测2型猪链球菌的RPA专用引物，是根据2型猪链球菌cps2J基因保守序列设计的，所述2型猪链球菌cps2J基因保守序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列SEQ ID NO.1：ATGGAAAAAGTCAGCATTATTGTACCTATTTTTAATACGGAAAAGTACTTAAGAGAGTGTTTAGATAGCATTATTTCCCAATCGTATACTAATCTAGAGATTCTTTTGATAGATGACGGTTCTTCAGATTCATCAACGGATATATGTTTGGAATACGCAGAGCAAGATGGTAGAATAAAACTTTTCCGGTTACCAAATGGTGGTGTTTCAAACGCAAGGAATTACGGTATCAAAAATAGCACAGCAAATTATATTATGTTTGTAGATTCTGATGATATTGTTGACGGCAACATTGTTGAGTCCTTATACACCTGTTTAAAAGAGAATGATAGTGATTTGTCGGGAGGGTTACTTGCTACTTTTGATGGAAATTATCAAGAATCTGAGCTGCAAAAGTGTCAAATTGATTTGGAAGAGATAAAAGAGGTGCGAGACTTAGGAAATGAAAATTTTCCAAATCATTATATGAGCGGTATCTTTAATAGCCCTTGTTGCAAACTTTATAAGAATATATATATAAACAAAGGTTTTGACACTGAACAGTGGTTAGGAGAGGACTTATTATTTAATCTAAATTATTTAAAGAATATAAAAAAAGTCAGCTATGTAAACAGAAATCTTTATTTTGCTAGAAGAGGTATACAAAGTACTACAAATACGTTTAAAAAAGATGTTTTTATTCAATTAGAAAATTTAGAAGAAAAAACTTTTGATTTGTTTGTTAAAATATTTGGTGGACAATATGAATTTTCTGTTTTTAAAGAGACGCTACAGTGGCATATTATTTATTATAGCTTATTAATGTTCAAAAATGGAGATGAATCGCTTCCAAAGAAATTGCATATATTTAAGTATTTATACAATAGGCATTCTTTAGATACTCTAAGTATTAAACGAACGTCCTCTGTTTTTAAAAGAATATGTAAATTAATTGTTGCTAATAATTTGTTTAAAATTTTTTTAAATACTTTAATTAGGGAAGAAAAAAATAATGATTAA 。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测2型猪链球菌的RPA专用引物，是根据2型猪链球菌cps2J基因保守序列设计的，所述2型猪链球菌cps2J基因保守序列具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列SEQIDNO.1：ATGGAAAAAGTCAGCATTATTGTACCTATTTTTAATACGGAAAAGTACTTAAGAGAGTGTTTAGATAGCATTATTTCCCAATCGTATACTAATCTAGAGATTCTTTTGATAGATGACGGTTCTTCAGATTCATCAACGGATATATGTTTGGAATACGCAGAGCAAGATGGTAGAATAAAACTTTTCCGGTTACCAAATGGTGGTGTTTCAAACGCAAGGAATTACGGTATCAAAAATAGCACAGCAAATTATATTATGTTTGTAGATTCTGATGATATTGTTGACGGCAACATTGTTGAGTCCTTATACACCTGTTTAAAAGAGAATGATAGTGATTTGTCGGGAGGGTTACTTGCTACTTTTGATGGAAATTATCAAGAATCTGAGCTGCAAAAGTGTCAAATTGATTTGGAAGAGATAAAAGAGGTGCGAGACTTAGGAAATGAAAATTTTCCAAATCATTATATGAGCGGTATCTTTAATAGCCCTTGTTGCAAACTTTATAAGAATATATATATAAACAAAGGTTTTGACACTGAACAGTGGTTAGGAGAGGACTTATTATTTAATCTAAATTATTTAAAGAATATAAAAAAAGTCAGCTATGTAAACAGAAATCTTTATTTTGCTAGAAGAGGTATACAAAGTACTACAAATACGTTTAAAAAAGATGTTTTTATTCAATTAGAAAATTTAGAAGAAAAAACTTTTGATTTGTTTGTTAAAATATTTGGTGGACAATATGAATTTTCTGTTTTTAAAGAGACGCTACAGTGGCATATTATTTATTATAGCTTATTAATGTTCAAAAATGGAGATGAATCGCTTCCAAAGAAATTGCATATATTTAAGTATTTATACAATAGGCATTCTTTAGATACTCTAAGTATTAAACGAACGTCCTCTGTTTTTAAAAGAATATGTAAATTAATTGTTGCTAATAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐永，李越希，李晓玲，李佳萌，饶继先，沈万鹏，曾雯雯，刘苏云，林煜，郑书龙，邓艺，郦钰超，
申请(专利权)人：李佳萌，
类型：发明
国别省市：江苏,32