一种检测立氏立克次体的RPA方法、其专用引物和探针及用途技术

本发明专利技术提供了用于检测立氏立克次体的RPA检测方法，其专用引物、探针及其在立氏立克次体检测中的用途。所述检测方法、其专用引物和探针是基于立氏立克次体基因保守序列设计，具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列。本发明专利技术首次将新型恒温扩增技术RPA应用于立氏立克次体的检测中，该方法模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合，包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，对DNA模板进行扩增，可在37℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，扩增产物可通过侧向层析核酸检测试纸条实现可视化判别。本发明专利技术建立的检测方法灵敏度可达6拷贝数/μL，特异性高，对硬件设备的要求低，且可在30min内完成检测，无需对样品进行复杂处理、适合现场检测，适于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测立氏立克次体的RPA方法、其专用引物和探针及用途
本专利技术属于生物
，涉及立氏立克次体的分子生物学，涉及一种检测立氏立克次体的方法及其用途，特别涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增技术（RPA技术）快速检测立氏立克次体的方法、其专用引物和探针及其用途。
技术介绍
立氏立克次体（Rickettsiarickettsii，Rr）俗称斑点热，为落基山斑点热的病原体，为专性细胞内寄生的小革兰氏阴性菌，对外界环境抵抗力强、存活时间长，人类和动物普遍易感，且可通过气溶胶广泛传播，是高致死性、已生物战剂化的病原体之一。立氏立克次体主要侵犯动静脉内皮细胞造成血管炎症和通透性增加，严重时凝血系统和激肽系统被激活，引起血栓性阻塞、血管肌层坏死以及中枢神经系统的微栓塞，使心脏、肺脏、肾脏和中枢神经系统等主要器官功能损害。病理变化程度比恙虫病和斑疹伤寒严重。临床表现为食欲减退、疲倦、四肢无力和畏寒等症状，典型患者突然起病，体温急剧上升到39-40℃，严重患者可出现41℃以上的超高热伴有寒战、剧烈头痛、全身肌肉和关节疼痛、畏光和眼球后痛肝脾可出现肿大。未经病原治疗，发热不退，热程可达2-3周，以后多数患者发热缓慢消退。误诊和漏诊情况严重。目前，对立氏立克次体的检测方法主要包括平板分离培养法、血清学技术、荧光定量PCR法。但是，这些方法存在成本较高、需要特定设备、耗时且需对样品进行复杂处理等缺陷，导致它们的实际应用范围严重受限。建立一种简单、快速、适合现场应用的立氏立克次体的检测方法有重要意义。近几年来，恒温核酸扩增技术得到了快速发展，其中英国TwistDxInc公司开发的重组酶聚合酶恒温扩增（RecombinasePolymeraseAmplification，RPA）被誉为是可替代PCR的核酸检测技术，其是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合（重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶）对DNA模板进行扩增，可在25-43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。
技术实现思路
本专利技术检测立氏立克次体的RPA方法，所要解决的技术问题是提供一组用于快速检测立氏立克次体的特异性引物和探针，以及一种能快速、简便、特异的检测立氏立克次体的检测方法。因此本专利技术检测立氏立克次体的RPA方法，第一个目的是提供用于检测立氏立克次体的引物，包括正向引物和反向引物，共两条。所述引物是根据立氏立克次体的保守基因设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了立氏立克次体基因的保守区，此区域为立氏立克次体基因组（GenBank:CP018914.1）位于第726782至727469核苷酸位点的一段序列，含有688个碱基的核苷酸片段，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。从SEQIDNO.1序列内筛选设计特异性引物。筛选的特异性引物包括正向引物rrF53和反向引物rrR379，分别位于基因组第726834至726863核苷酸位点和第727131至727160核苷酸位点，分别具有如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的寡核苷酸序列，引物的长度为30bp左右，其中反向引物5’端标记生物素（Biotin）。正向引物和反向引物扩增完成后获得的双链DNA将标记有生物素。SEQIDNO.1：AAGATAATTAATCGCTTATTATTAAAAATTTTCATTTTTTTATTATTTATTACTAGCAATAATCTGTGTTATTTGATAAAATTAAATCTAAAAGAAAGGGAAAGTGTATGAGTAATATTAACGCTAAGTTTTACATACCATTGGTGTCACTACTTGGTGTATTCATTTATTTACTAAATTGTTTTAATAAAATATCTCAGTGTTCTTTAGTATTTGTGTTTTTAGCTATAACTACCAATATTATATCTGAGCTATATGGTAGAAAGAGAGCTTTGATTGCTGTGGCGTTATGTATAATAGTAAGTTTTGGTTTGTTATGGAACTTCAATTATTATATTCATGGTCGTGTTATTAAAGGAGTTGTTTTTGCATCTTTTGTATCTGTATTATTATCAACATATTGTAGTACAAGTATATTTTCACAACTTAAGCCAAGATGTTCTTTGAATACAAGAAATTTTGCTAGTTTAATAATGTGTGCGGTCGTAGATGGTATTGTGATGTCAGGATTTTTTGTAAATGTATTCTCTACAAGTAAAGTTTTGTCGATATTTTATAAAGAAGTATTATATAAATGTGCATATTCATTAACAGTTTATATCTGTATATTTTTAGTTCAAAAAGTATATGGCAATAATGGGAGTGTCCGCGCACTGAAAAATTTTTGAATAAAAAATATAGCTAACCTSEQIDNO.2：5’CTAGCAATAATCTGTGTTATTTGATAAAAT3’SEQIDNO.3：5’ACAAAAGATGCAAAAACAACTCCTTT3’本专利技术检测立氏立克次体的RPA方法，第二个目的是提供用于检测立氏立克次体的探针。所述探针是根据立氏立克次体的保守基因，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了立氏立克次体基因的保守区，此区域含有688个碱基的核苷酸片段，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。从SEQIDNO.1序列内筛选设计特异性探针，设计探针位于基因组第726913至726958核苷酸位点，具有SEQIDNO.4所示的寡核苷酸序列，，且5’端标记荧光素FAM，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），在第30-31位碱基之间插有一个四氢呋喃（THF）。SEQIDNO.4：5’TACATACCATTGGTGTCACTACTTGGTGTA[THF]TCATTTATTTACTAA3’所述探针的长度为45bp，其中5’端30bp，3’端15bp。所述探针由荧光素（羧基荧光素FAM）、5’端序列、四氢呋喃（THF）、3’端序列及3’端延伸阻断基团（磷酸基团）组成。所述探针与扩增后的标记有生物素的DNA退火，RPA系统中的nfo酶将在THF部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获得FAM和Biotin双标记的扩增产物。本专利技术检测立氏立克次体的RPA方法，第三个目的是提供了用于立氏立克次体快速检测的RPA检测方法，所述方法采用上述的RPA引物和探针进行扩增，并结合侧向层析核酸检测试纸条(Hybridetect2T，MileniaBiotecGmbH,Germany)进行可视化判断。本专利技术所述的检测立氏立克次体的RPA方法，包括以下步骤：（1）以待测样品基因组DNA为模板，在所述引物组和探针的标记下进行RPA反应；（2）结果判断：用上述侧向层析核酸检测试纸条对回收后的RPA产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测立氏立克次体的RPA专用引物，是根据立氏立克次体特异性保守序列设计的，所述立氏立克次体特异性保守序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列SEQ ID NO.1：AAGATAATTAATCGCTTATTATTAAAAATTTTCATTTTTTTATTATTTATTACTAGCAATAATCTGTGTTATTTGATAAAATTAAATCTAAAAGAAAGGGAAAGTGTATGAGTAATATTAACGCTAAGTTTTACATACCATTGGTGTCACTACTTGGTGTATTCATTTATTTACTAAATTGTTTTAATAAAATATCTCAGTGTTCTTTAGTATTTGTGTTTTTAGCTATAACTACCAATATTATATCTGAGCTATATGGTAGAAAGAGAGCTTTGATTGCTGTGGCGTTATGTATAATAGTAAGTTTTGGTTTGTTATGGAACTTCAATTATTATATTCATGGTCGTGTTATTAAAGGAGTTGTTTTTGCATCTTTTGTATCTGTATTATTATCAACATATTGTAGTACAAGTATATTTTCACAACTTAAGCCAAGATGTTCTTTGAATACAAGAAATTTTGCTAGTTTAATAATGTGTGCGGTCGTAGATGGTATTGTGATGTCAGGATTTTTTGTAAATGTATTCTCTACAAGTAAAGTTTTGTCGATATTTTATAAAGAAGTATTATATAAATGTGCATATTCATTAACAGTTTATATCTGTATATTTTTAGTTCAAAAAGTATATGGCAATAATGGGAGTGTCCGCGCACTGAAAAATTTTTGAATAAAAAATATAGCTAACCT 。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测立氏立克次体的RPA专用引物，是根据立氏立克次体特异性保守序列设计的，所述立氏立克次体特异性保守序列具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列SEQIDNO.1：AAGATAATTAATCGCTTATTATTAAAAATTTTCATTTTTTTATTATTTATTACTAGCAATAATCTGTGTTATTTGATAAAATTAAATCTAAAAGAAAGGGAAAGTGTATGAGTAATATTAACGCTAAGTTTTACATACCATTGGTGTCACTACTTGGTGTATTCATTTATTTACTAAATTGTTTTAATAAAATATCTCAGTGTTCTTTAGTATTTGTGTTTTTAGCTATAACTACCAATATTATATCTGAGCTATATGGTAGAAAGAGAGCTTTGATTGCTGTGGCGTTATGTATAATAGTAAGTTTTGGTTTGTTATGGAACTTCAATTATTATATTCATGGTCGTGTTATTAAAGGAGTTGTTTTTGCATCTTTTGTATCTGTATTATTATCAACATATTGTAGTACAAGTATATTTTCACAACTTAAGCCAAGATGTTCTTTGAATACAAGAAATTTTGCTAGTTTAATAATGTGTGCGGTCGTAGATGGTATTGTGATGTCAGGATTTTTTGTAAATGTATTCTCTACAAGTAAAGTTTTGTCGATATTTTATAAAGAAGTATTATATAAATGTGCATATTCATTAACAGTTTATATCTGTATATTTTTAGTTCAAAAAGTATATGGCAATAATGGGAGTGTCCGCGCACTGAAAAATTTTTGAATAAAAAATATAGCTAACCT。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述引物中的正向引物具有SEQIDNO.2所示的寡核苷酸序列，反向引物具有SEQIDNO.3所示的寡核苷酸序列，且5’端标记生物素（Biotin...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐永，李越希，邵银秀，尹琼，曹勇平，陈红霞，陈乐如，饶继先，李佳萌，沈万鹏，李素芹，徐亭亭，杨彬彬，
申请(专利权)人：李佳萌，
类型：发明
国别省市：江苏,32