用于衣原体检测的引物、试剂盒及方法技术

一种基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的动物衣原体检测方法，该方法采用重组酶和单链结合蛋白在常温下协同实现引物与模板的特异性结合，在DNA聚合酶的作用下延伸引物生成新的DNA链。本发明专利技术的特征在于，根据衣原体基因envB序列设计并筛选了一套可用于RPA检测的引物及探针组合，建立了一种动物衣原体特异性荧光RPA检测方法。本发明专利技术之衣原体特异性荧光RPA检测方法操作简便、快速、特异性强，适用于现场快速检测。

Primers, kits and methods for Chlamydia detection

A method for detection of Chlamydia in animals based on recombinant enzyme polymerase amplification technology (RPA) is proposed. The method combines recombinant enzyme and single chain binding protein to achieve specific binding of primers and templates at room temperature. It extends primers to generate new DNA chains under the action of DNA polymerase. The invention is based on the Chlamydia gene envB sequence, and designs and selects a set of primers and probe combinations which can be used for RPA detection, and establishes a detection method for Chlamydia specific Chlamydia RPA. The method of detection of Chlamydia specific fluorescence RPA is simple, fast and specific, and is suitable for rapid detection in the field.

【技术实现步骤摘要】
用于衣原体检测的引物、试剂盒及方法
本专利技术涉及一种用于检测动物衣原体的引物及相关探针，以及检测试剂盒，确切讲是一种检测动物衣原体的特异性荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测引物、试剂盒，本专利技术还涉及利用本专利技术的引物与探针或试剂盒进行非疾病诊断的动物衣原体病的检测方法。
技术介绍
衣原体(Chlamydia)是严格胞内寄生的革兰氏阴性细菌，直径0.2～0.5μm，介于立克次体和病毒之间，能够通过0.45μm滤膜，只能在宿主细胞内生长，不能像大部分细菌一样生长在琼脂平板上。衣原体病原具有广泛的致病性，近年来，衣原体病在我国流行较为严重，尤其是奶牛、牦牛、绵羊、山羊、猪等，严重阻碍了奶牛产业、牦牛产业等的进一步发展，并造成了巨大的经济损失。此外，作为一种重要的人畜共患病，该病能够引起动物和人的多种疾病，感染人可导致沙眼、肺炎、泌尿系统疾病等。因此，及时、及早的发现衣原体，并采用敏感、特异的诊断方法，在准确诊断动物流产嗜性衣原体病，提供科学防控衣原体病的诊断依据，促进养殖业健康发展，保证食品安全，保护人民身体健康方面尤为重要。多年来，国内外对于衣原体病的诊断方法主要包括衣原体抗原的检测、衣原体抗体检测以及分子生物学检测方法。抗原检测主要包括姬姆萨染色、酶免检测(EIA)以及分离培养，其中酶免检测诊断方法适用于批量检测，其缺点是特异性不佳，分离培养仍然是一个不可或缺的衣原体诊断方法，同时许多菌株是很难培养的，也存在着支原体污染的常见问题。抗体检测法主要包括间接血凝试验(IHA)、补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)以及微量间接免疫荧光试验(MIF)。其中，间接血凝诊断试验和补体结合试验这两种方法均具有灵敏度低、特异性差、结果判断主观性强和不适合大批量检测等特点，限制了它们在临床中的广泛应用。ELISA诊断法以针对脂多糖类抗原的较多，但衣原体脂多糖类抗原某些表位与其它革兰氏阴性细菌相似，容易出现交叉反应和假阳性。例如现有技术CN201110367644.0公开了一种检测猪流产嗜性衣原体抗体的ELISA试剂盒是以重组衣原体主要外膜蛋白rMOMP为包被抗原，以及现有技术中以重组多型性外膜蛋白POMP为包被抗原建立的猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法，但是这些现有技术均是针对特定一种动物开发的ELISA抗体间接检测方法或试剂盒，适用范围窄，不具有通用性，无法用于多种动物的衣原体检测诊断，使用成本较高，难以普及。微量间接免疫荧光试验曾被推荐为诊断肺炎衣原体的最可靠的血清学方法，但该诊断方法技术要求高、耗时长，因此并没有成为肺炎衣原体的常用检测项目。分子生物学检测方法主要包括核酸杂交法、PCR检测法以及环介导等温扩增技术(LAMP)。RPA技术是由以英国剑桥Babraham研究院建立的并由TwistDx生物技术公司专利技术的(http://www.twistdx.co.uk/)。该技术以T4噬菌体的核酸复制机制为原理，反应所需原料有T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsX和uvsY、单链结合蛋白gp32、DNA聚合酶以及寡聚核苷酸；同时还需要引物、探针、模板、ddH2O和Mg2+等。该技术基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟生物体内DNA复制，在常温下即可对目标片段进行等温扩增，摆脱了对热循环仪器的要求，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便，快速，灵敏等优点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供：一种可克服现有技术不足，用于检测动物衣原体特异性检测的引物对；一种用于动物衣原体检测的引物对序列荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测探针序列；一种用于检测动物衣原体特异性的检测试剂盒；一种方法。一种用于动物衣原体荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测试剂盒；以及用于动物衣原体病的检测方法和荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法。本专利技术的用于动物衣原体检测的引物对序列为SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。本专利技术的用于动物衣原体RPA检测的探针序列，其特征在于为SEQIDNo.4。本专利技术用于动物衣原体检测的试剂盒内包括有序列为SEQIDNo.2和SEQIDNo.3的引物对。本专利技术用于动物衣原体RPA检测的试剂盒内包括有序列为SEQIDNo.2和SEQIDNo.3的引物对，以及序列为SEQIDNo.4的探针序列。本专利技术的非疾病诊断动物衣原体检测方法是：将待检测动物样品的基因组DNA为模板，用SEQIDNo.2、SEQIDNo.3进行扩增，并根据扩增产物电泳中是否有特定条带确定被检测动物是否有衣原体感染。本专利技术的非疾病诊断动物衣原体荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法是：将待检测动物样品的基因组DNA为模板，用SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4进行扩增，确定被检测采用荧光定量PCR仪进行信号检测，并根据检测上曲率明显改变与否确定被检动物是否有衣原体感染。专利技术的方法有极高的检测灵敏度，而且检测方法较为简单，特别是采用本专利技术的动物衣原体荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法时，更具有简便、快速、有效的优点，对于动物衣原体的防控具有重要意义。目前RPA技术已经在一系列病原微生物的分子检测中得到应用，如结核分枝杆菌、口蹄疫病毒、犬细小病毒、非洲猪瘟等。但是未见RPA技术在衣原体检测中的应用。因此，本专利技术建立了一种简便、快速、有效的衣原体RPA检测方法，对于衣原体的防控具有重要意义。附图说明图1为引物的PCR验证：M为DL2000DNAmarker；1～6为6对RPA扩增引物的PCR扩增结果。图2为引物的RPA验证：M为DL2000DNAmarker；1、3、6为3对引物的BasickitRPA扩增结果；—：为阴性对照；+：为阳性对照。图3为RPA荧光检测方法特异性分析：A:阴性对照；B:阳性对照；C、D:两株衣原体基因组扩增结果；E:布鲁氏杆菌基因组检测结果；F:弓形虫基因组检测结果图4为RPA荧光检测方法灵敏度分析：A为模板浓度为107copies/μL的扩增曲线；B为模板浓度为106copies/μL的扩增曲线；C为模板浓度为105copies/μL的扩增曲线；D为模板浓度为104copies/μL的扩增曲线；E为模板浓度为103copies/μL的扩增曲线；F为模板浓度为102copies/μL的扩增曲线；G为模板浓度为101copies/μL的扩增曲线。具体实施方式以下为本专利技术的具体实施方式，本专利技术所使用的主要材料、试剂、食品如下：菌株、载体与基因组：大肠杆菌感受态细胞DH5α、DNAMarker和pMD18-Tsimple载体均购于TaKaRaBiotech公司；衣原体、布鲁氏杆菌和弓形虫基因组DNA均为本实验室保存。主要试剂与试剂盒：甲醇、乙醇、异丙醇、以及丙三醇等购于天津化学试剂有限公司；氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等购自于北京化工厂；PCR预混酶ExTaq、质粒提取试剂盒、PCR纯化回收试剂盒、胶回收试剂盒、pMD18-T载体连接试剂盒等均购自于TaKaRaBiotech公司。主要仪器：移液器、PCR仪均购于德国Eppendorf公司；电子天平为北京赛多斯仪器系统有限公司产品；电热恒温培养箱购于上海精密实验设备公司；DYY-6C电泳仪、水平摇本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于动物衣原体检测的引物对序列，其特征在于为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。

【技术特征摘要】
1.用于动物衣原体检测的引物对序列，其特征在于为SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。2.用于动物衣原体RPA检测的探针序列，其特征在于为SEQIDNo.4。3.一种用于动物衣原体检测的试剂盒，其特征在于试剂盒内包括有序列为SEQIDNo.2和SEQIDNo.3的引物对。4.一种用于动物衣原体RPA检测的试剂盒，其特征在于试剂盒内包括有序列为SEQIDNo.2和SEQIDNo.3的引物对，以及序列为SEQIDNo.4的探针序列。5.一种非疾病...

【专利技术属性】
技术研发人员：周继章，李兆才，娄忠子，费媛媛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62