连接酶辅助的核酸环化和扩增制造技术

本文提供了用于在单个反应容器中从线性DNA生成和扩增单链DNA环而无需任何介入的纯化步骤的方法。所述单链DNA环经由非模板依赖性单链DNA连接生成。亦提供了使用连接酶辅助的DNA扩增在单管中对线性染色体DNA进行全基因组扩增。

Ligase assisted nucleic acid cyclization and amplification

This paper provides a method for the generation and amplification of single stranded DNA rings from linear DNA in a single reactor without any intervention in the purification step. The single stranded DNA rings are generated through a non template dependent single strand DNA connection. Genome wide amplification of linear chromosome DNA in single tube was also provided using ligase assisted DNA amplification.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】连接酶辅助的核酸环化和扩增专利
本专利技术一般涉及用于在单个反应容器中经由滚环扩增来扩增线性核酸序列而无需任何介入的分离和/或纯化步骤的方法。所述方法包括经由非模板依赖性的单链DNA连接从单链或双链线性DNA生成单链DNA环，接着使用专门的引物序列进行滚环扩增。所述方法进一步涉及使用随机引物混合物经由滚环扩增在单个反应容器中进行的线性染色体DNA的全基因组扩增，随后对其进行检测。背景DNA扩增为复制双链靶DNA(dsDNA)以生成其多个拷贝的过程。因为dsDNA的各链为反向平行且互补的，所以每条链均可充当用于产生其互补链的模板链。将所述模板链整体保留或保留为截短的部分，并通过DNA聚合酶从脱氧核苷三磷酸(dNTP)组装互补链。所述互补链合成从与所述模板链杂交的引物序列的3’末端开始，沿5’→3’方向进行。全基因组扩增(WGA)涉及靶DNA的非特异性扩增。WGA常常通过使用用于在靶DNA的多个位点引发DNA合成的随机寡核苷酸引物连同具有链置换活性的高保真DNA聚合酶(例如Phi29聚合酶)的多重置换扩增(MDA)技术来实现。尽管诸如GenomiPhi(GEHealthcare，美国)和RepliG(Qiagen)试剂盒等目前可得的商品化WGA系统在高分子量靶DNA的情况下提供最佳结果，但是，当靶DNA较短和/或高度片段化时，这些系统的性能不佳。当靶DNA为片段化的且序列长度小于约1000个核苷酸时，使用常规方法扩增靶DNA导致降低的扩增速度、尤其在靶DNA的末端附近的显著的序列缺失、以及高度序列偏好的扩增。随着模板DNA的长度减小，该链在MDA反应中得到多重引发的可能性减小。这降低了这些较短片段的扩增潜能。因此，用于非特异性地扩增短的片段化DNA的有效方法为极其需要的。连接介导的聚合酶链反应(PCR)已用于扩增片段化的dsDNA。然而，仅一小部分的片段化DNA在这些反应中得到扩增，导致不足的基因组覆盖度。为有效扩增片段化的靶dsDNA，可首先对其进行修复并随后通过平端连接串联(concatamerized)以生成长于1000个碱基对(bp)的序列。然而，常常需要相对较高浓度的靶DNA来促进串联和后续扩增。双链靶DNA的环化亦已用于多种基于核酸的试验，包括MDA、WGA、超支化滚环扩增(RCA)和大规模平行DNA测序。为使片段化的dsDNA有效地环化和扩增，首先对片段化DNA的双链末端进行修复，接着进行平端连接以形成双链DNA环。然而，难以将长度小于500bp的双链DNA片段环化。可使双链DNA变性以产生单链DNA(ssDNA)，可使用连接酶在模板依赖性分子内连接反应中将其进一步环化。然而，需要靶DNA的在先序列信息来进行模板依赖性环化。ssDNA的非模板依赖性分子内连接亦已有文献记录。例如，TS2126RNA连接酶(以商标THERMOPHAGETMRNA连接酶II或THERMOPHAGETMssDNA连接酶(Prokaria，Matis，冰岛)或CIRCLIGASETMssDNA连接酶(EpicenterBiotechnologies，Wisconsin，美国)市购可得)已用于制备数字DNA球(digitalDNAball)和/或诸如基因组DNA等DNA的基因座特异性断裂和扩增。CIRCLIGASEITM具有低腺苷化程度(约30%)，而CIRCLIGASEIITM包含基本上腺苷化形式的TS2126RNA连接酶。在使用TS2126RNA连接酶环化之后，亦经由滚环复制扩增从mRNA的5’-端片段制备的线性单链互补DNA(cDNA)分子。通过向cDNA中适当掺入正义RNA聚合酶启动子序列，环化的cDNA模板显示为充当转录底物并因此实现生物样品中的mRNA分子的扩增。另外，已使用TS2126RNA连接酶扩增cDNA末端，以用于cDNA末端的随机扩增(RACE)。亦已通过使用TS2126RNA连接酶，从有限量的片段化DNA生成用于滚环扩增的DNA模板。所述方法包括使线性的片段化dsDNA变性以获得线性ssDNA片段，用CIRCLIGASETMssDNA连接酶将线性ssDNA连接以获得单链DNA环，并随后使用随机引物和Phi29DNA聚合酶经由RCA来扩增单链DNA环。然而，即便在优化反应条件之后，生成的单链环状DNA的量亦为高度变化且序列依赖性的。例如，在相同的连接条件下，包含5’G和3’T核苷酸的寡核苷酸，与包含5’A和3’C的其互补寡核苷酸相比，显著更好地连接。另外，在具有相同或非常相似大小但在核苷酸序列上有少许差异的线性ssDNA序列之间，分子内连接效率不同。在不同大小的线性ssDNA序列之间(例如大小范围为从100个碱基到上千碱基的序列长度)，效率亦不同。此外，连接-扩增反应的所有尝试均包括中间分离、纯化和/或净化步骤，因而使连接-扩增工作流变麻烦。例如，通过环化接着滚环扩增的片段化DNA的法医样品的分析，以多个步骤实施，包括5’DNA磷酸化、衔接头连接、DNA环化和全基因组扩增。在进行下一步骤之前，各步反应均要经历反应净化。另外，多步过程常常导致模板DNA的损失并导致分析失败。当在单个反应容器进行连接和扩增时，未观察到扩增优势；反而常常发现转入下一步的连接反应的组分对于后续扩增反应是抑制性的。因此，用于在单个反应容器中非特异性扩增短DNA序列而无需任何介入的净化步骤的有效方法，为极其需要的，特别是在需要具代表性且均衡的全基因组信息的情况下。另外，克服由各连接-扩增中的反应物导致的抑制的用于在单个反应容器中经由滚环扩增来扩增线性核酸序列的方法，为极其需要的。概述在一些实施方案中，提供了用于经由滚环扩增来扩增线性染色体DNA的方法。所述方法包括以下步骤：提供线性染色体DNA，使用能够进行单链DNA的非模板依赖性分子内连接的连接酶进行线性染色体DNA的分子内连接以生成单链DNA环，以及经由滚环扩增来扩增单链DNA环。滚环扩增使用这样的随机引物混合物，其包含具有至少一种核苷酸类似物的寡核苷酸序列。所述方法的所有步骤，包括连接反应和滚环扩增反应，均在单个反应容器中进行而无需任何介入的分离或纯化步骤。如果线性染色体DNA为双链形式的，则在分子内连接反应之前使之变性以生成单链DNA。在一些实施方案中，将所述方法用于靶DNA的全基因组扩增。附图简述当参考附图来阅读下列详述时，本专利技术的这些及其它特征、方面和优点将变得更好理解。图1阐述片段化dsDNA的连接酶辅助的全基因组扩增的一个实施方案的图示。图2阐述从健康个体的血浆中分离的循环DNA的大小概况。图3A阐述使用CIRCLIGASEIITM进行的从全血的非细胞级分中提取的循环DNA的连接酶辅助的全基因组扩增。图3B阐述使用T4DNA连接酶进行的从全血的非细胞级分中提取的循环DNA的连接酶辅助的全基因组扩增。图3C阐述使用大肠杆菌(E.Coli)DNA连接酶进行的从全血的非细胞级分中提取的循环DNA的连接酶辅助的全基因组扩增。图4阐述连接酶辅助的全基因组扩增用于四种不同的CODIS基因座的灵敏且均衡的DNA扩增的有效性。图5阐述连接酶辅助的全基因组扩增用于十二种不同的CODIS基因座的灵敏且均衡的DNA扩增的有效性。图6阐述连接酶辅助的全基因组扩增在不同的反本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于核酸扩增的方法，所述方法包括：(a)提供线性染色体DNA；(b)将所述线性染色体DNA与能够进行单链DNA序列的非模板依赖性分子内连接的连接酶一起孵育，以生成单链DNA环，和(c)使用随机引物混合物，经由滚环扩增来扩增所述单链DNA环以形成扩增的DNA产物，其中所述随机引物混合物包含含有至少一种核苷酸类似物的寡核苷酸序列，和其中所述方法的所有步骤均在单个反应容器中进行而无需任何介入的分离或纯化步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.05 US 14/9332751.一种用于核酸扩增的方法，所述方法包括：(a)提供线性染色体DNA；(b)将所述线性染色体DNA与能够进行单链DNA序列的非模板依赖性分子内连接的连接酶一起孵育，以生成单链DNA环，和(c)使用随机引物混合物，经由滚环扩增来扩增所述单链DNA环以形成扩增的DNA产物，其中所述随机引物混合物包含含有至少一种核苷酸类似物的寡核苷酸序列，和其中所述方法的所有步骤均在单个反应容器中进行而无需任何介入的分离或纯化步骤。2.权利要求1的方法，其中所述至少一种核苷酸类似物包含2-氨基-脱氧腺苷。3.权利要求1的方法，其中所述至少一种核苷酸类似物包含2-硫代-脱氧胸苷。4.权利要求1的方法，其中所述随机引物混合物包含选择性结合互补寡核苷酸。5.权利要求4的方法，其中所述选择性结合互补寡核苷酸的各成员包含至少一个含2-氨基-脱氧腺苷的核苷酸或至少一个含2-硫代-脱氧胸苷的核苷酸。6.权利要求1的方法，其中所述随机引物混合物包含这样的寡核苷酸序列，其含有硫代磷酸酯修饰的核苷酸、LNA核苷酸、包含2-氨基-脱氧腺苷的核苷酸、包含2-硫代-脱氧胸苷的核苷酸、或其组合。7.权利要求1的方法，其中所述随机引物混合物为六聚体，其包含具有通用结构+N+N(atN)(atN)(atN)*N的寡核苷酸序列。8.权利要求1的方法，其中所述随机引物混合物中的各寡核苷酸序列均包含至少一种核苷酸类似物。9.权利要求1的方法，其中所述随机引物混合物的浓度高于所述单链DNA环的浓度，以促进多重随机引发的滚环扩增。10.权利要求1的方法，其中所述线性染色体DNA选自无细胞循环DNA、从福尔马林固定的石蜡包埋样品分离的DNA、已暴露给环境条件的法医DNA样品、古代DNA样品及其组合。11.权利要求1的方法，其中所述线性染色体DNA为片段化的DNA。12.权利要求1的方法，如果所述线性染色体DNA为双链形式的，则其进一步包括在...

【专利技术属性】
技术研发人员：RC赫勒，EL克瓦姆，JR内尔森，
申请(专利权)人：通用电气公司，
类型：发明
国别省市：美国,US