用于LAMP检测的可视化混合染料制造技术

本发明专利技术公开了一种用于LAMP可视化检测的混合染料，用于LAMP可视化检测的混合染料，它包括，试剂A和试剂B的体积比为1.8～2.2:1，所述的试剂A为钙黄绿素粉末和氯化锰粉末用去核酸酶水溶解，钙黄绿素浓度为600～650µM，氯化锰浓度为10～15mM；所述的试剂B为羟基萘酚蓝粉末用去核酸酶水溶解，浓度为13～17mM；本发明专利技术优点在于：与目前常见染料相比，该新型混合染料使LAMP反应结果更容易判读，阴、阳性结果间颜色差异更加明显，极大程度避免了结果的误判；（2）该新型混合染料预先添加于LAMP扩增反应液中，使LAMP反应后，不必再打开管盖，避免了对实验室环境造成核酸污染；（3）该新型混合染料为非DNA嵌入型染料，对LAMP反应干扰小，不影响LAMP检测的灵敏度。

Visual mixed dyes for LAMP detection

The present invention discloses a mixed dye for visual detection of LAMP, which is used for LAMP visual detection of mixed dyes. The volume ratio of reagent A and reagent B is 1.8 to 2.2:1, the reagent A is calcium chlorotexin powder and manganese chloride powder dissolving with nuclease water, the concentration of calcalin is 600~650 M, and manganese chloride is strong. The reagent B is 10 ~ 15mM, and the reagent B is hydroxy naphthol blue powder dissolving with nuclease water and the concentration is 13 to 17mM. The advantage of the invention is that compared with the current common dyestuffs, the new mixed dye makes the result of the reaction more easily read, the color difference between the negative and positive results is more obvious, and the error of the result is avoided to a great extent. (2) (2) the new mixed dye is added to the reaction liquid in advance. After the reaction of LAMP, it does not need to open the tube cover and avoid the nucleic acid pollution to the laboratory environment. (3) the new mixed dye is a non DNA embedded dye, which has little interference to the reaction of the LAMP reaction, and does not affect the sensitivity of the LAMP detection.

【技术实现步骤摘要】
用于LAMP检测的可视化混合染料
本专利技术属分子生物学领域，具体涉及一种用于LAMP检测的可视化混合染料。
技术介绍
环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是一种近年来发展较快的核酸扩增技术。它能够在恒定温度下对目标核酸序列进行快速的扩增，进而实现目标物的检测。目前，LAMP结果的读取主要分为浊度检测、琼脂糖凝胶电泳检测和荧光/可视化染料检测3类方法。但由于浊度检测和电泳检测都依赖于仪器并需要较复杂操作，因而荧光/可视化染料检测方法越来越受到科学家的青睐。该方法只需在LAMP反应开始前于反应体系中加入染料，反应后，阴性反应试剂和阳性反应试剂即会呈现出颜色差异，从而实现反应结果的快速判读。目前，应用比较广泛的染料有如下两种：①羟基萘酚蓝（Hydroxynaphtholblue，HNB）。HNB作为LAMP反应可视化指示剂在2009年被首次报道。它的原理为：在LAMP扩增反应的核酸合成过程中，dNTP上大量的的焦磷酸根离子被解离出来，而焦磷酸根离子能与反应体系中的Mg2+特异性结合，使反应体系中Mg2+浓度下降，进而导致HNB-Mg2+复合物减少。从而使阳性反应在自然光下呈现蓝色，阴性反应呈现紫色。②钙黄绿素：钙黄绿素作为LAMP反应可视化指示剂在2008年被首次报道。它主要是通过在365nm蓝光激发下对结果进行鉴别。其在自然光下阴、阳性结果间也存在一定差异，但并不明显。它的原理为：首先在钙黄绿素中加入Mn2+，Mn2+使钙黄绿素的绿色荧光淬灭。当LAMP扩增反应发生后，产生的副产物焦磷酸离子与Mn2+结合并释放钙黄绿素，淬灭状态解除。最终呈现的结果为在365nm蓝光激发下，阳性反应发出强绿色荧光，阴性反应发出较弱绿色荧光。在自然光下，阳性反应呈浅绿色，阴性反应呈浅橘色。上述两种染料通常被单独使用。但它们存在着一个共同的缺陷，就是阴性与阳性结果间颜色差异不够明显。尤其是在自然光下，当待检物浓度过低时，弱阳性结果与阴性结果难以区分，从而导致结果判读的不准确。
技术实现思路
本专利技术为解决在LAMP反应时单独使用羟基萘酚蓝和钙黄绿素指示剂显色阴性与阳性结果间颜色差异不够明显的问题，而提供一种用于LAMP可视化检测的混合染料。用于LAMP可视化检测的混合染料，它包括，试剂A和试剂B的体积比为1.8～2.2:1，所述的试剂A为钙黄绿素粉末和氯化锰粉末用去核酸酶水溶解，钙黄绿素浓度为600～650µM，氯化锰浓度为10～15mM；所述的试剂B为羟基萘酚蓝粉末用去核酸酶水溶解，浓度为13～17mM；所述的试剂A中钙黄绿素的浓度为625µM，氯化锰的浓度为12.5mM；所述的试剂B中羟基萘酚蓝的浓度为15mM。LAMP扩增反应液，在10µL反应体系中，加入所述的用于LAMP可视化检测的混合染料0.4～0.7µL；所述混合染料0.6µL；所述的10µL反应体系为：5M甜菜碱1.6µL10mMdNTP混合液1.4µL10×等温扩增反应缓冲液1.0µL100mM硫酸镁溶液0.6µL混合染料0.6µL引物2.4µL8000U/mLBstDNA聚合酶0.4µLDNA模板2.0µL。本专利技术提供了一种用于LAMP可视化检测的混合染料，用于LAMP可视化检测的混合染料，它包括，试剂A和试剂B的体积比为1.8～2.2:1，所述的试剂A为钙黄绿素粉末和氯化锰粉末用去核酸酶水溶解，钙黄绿素浓度为600～650µM，氯化锰浓度为10～15mM；所述的试剂B为羟基萘酚蓝粉末用去核酸酶水溶解，浓度为13～17mM；本专利技术优点在于：与目前常见染料相比，该新型混合染料使LAMP反应结果更容易判读，阴、阳性结果间颜色差异更加明显，极大程度避免了结果的误判；（2）该新型混合染料预先添加于LAMP扩增反应液中，使LAMP反应后，不必再打开管盖，避免了对实验室环境造成核酸污染；（3）该新型混合染料为非DNA嵌入型染料，对LAMP反应干扰小，不影响LAMP检测的灵敏度。附图说明图1实施例2中自然光下反应结果照片及紫外—可见吸收光谱：A）含有新型混合染料的LAMP反应结果；B）含有单一HNB染料的LAMP反应结果；C）含有单一钙黄绿素染料的LAMP反应结果；图2含有不同染料的LAMP检测灵敏度比较；1-7号管：向LAMP扩增反应液中加入的SA-DNA质粒模板浓度依次为2.15×106copies/µL，2.15×105copies/µL，2.15×104copies/µL，2.15×103copies/µL，2.15×102copies/µL，2.15×101copies/µL，2.15×100copies/µL；NTC管：向LAMP扩增反应液中加入去核酸酶水。具体实施方式金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，SA）是常见病原菌，因此以检测SA为例，对本专利技术的具体实施方式作进一步的描述，但本专利技术并不局限于这些实施例。实施例1SA特征核酸序列的选择及对应LAMP引物的设计与合成根据种属特异性，SA的nuc基因中300bp保守核酸片段被选择为特征靶序列。针对这段序列，运用计算机软件对6条对应的LAMP引物（F3-nuc、B3-nuc、LF-nuc、LB-nuc、FIP-nuc、BIP-nuc）进行设计；所有的引物及含有SA特征核酸序列的DNA质粒模板均由生工生物工程（上海）股份有限公司代为合成。特征序列及引物序列如表1所示。实施例2新型混合染料、单一钙黄绿素染料和单一HNB染料在LAMP检测中的可视化效果比较1、新型混合染料、单一钙黄绿素染料和单一HNB染料储存液配置称取一定质量钙黄绿素粉末与氯化锰粉末置于同一容器内，用去核酸酶水溶解，使溶液中钙黄绿素的浓度为625µM，氯化锰的浓度为12.5mM；调节溶液PH值至弱碱性，充分混匀，获得的溶液为试剂A，即单一钙黄绿素染料储存液，4℃或-20℃保存待用；称取一定质量HNB粉末，用去核酸酶水溶解，使溶液中HNB的浓度为15mM，充分混匀，获得的溶液为试剂B，即单一HNB染料储存液，4℃或-20℃保存待用；将试剂A和试剂B按2:1体积比充分混匀，获得的溶液即为新型混合染料，4℃或-20℃保存待用。2、含有新型混合染料的LAMP扩增反应液配置3、含有单一钙黄绿素染料的LAMP扩增反应液配置4、含有单一HNB染料的LAMP扩增反应液配置5、LAMP反应将上述含有新型混合染料、单一钙黄绿素染料和单一HNB染料的LAMP扩增反应液置于63℃条件下，反应1小时，随后置于80℃条件下10分钟终止反应。6、结果读取在自然光下，肉眼观察反应液颜色变化。结果如图1所示，含有新型混合染料的阳性反应液呈绀蓝色，阴性反应液呈浅灰色；含有单一钙黄绿素染料的阳性反应液呈浅绿色，阴性反应液呈浅橘色；含有单一HNB染料的阳性反应液呈蓝色，阴性反应液呈紫色。依据肉眼判断，可清楚看出含有新型混合染料的试剂阴、阳性结果间颜色差异最为明显，最易于可视化结果的判读。7、紫外—可见吸收光谱扫描使用紫外—可见光分光光度计对上述反应后的试剂进行吸收光谱扫描。结果如图1所示，含有新型混合染料的阴、阳性反应液光谱形态差异最大，阳性结果为双峰型，阴性结果为单峰型；含有单一钙黄绿素染料和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 用于LAMP可视化检测的混合染料，它包括，试剂A和试剂B的体积比为1.8～2.2:1，所述的试剂A为钙黄绿素粉末和氯化锰粉末用去核酸酶水溶解， 钙黄绿素浓度为600～650µM，氯化锰浓度为10～15mM；所述的试剂B为羟基萘酚蓝粉末用去核酸酶水溶解，浓度为13～17 mM。

【技术特征摘要】
1.用于LAMP可视化检测的混合染料，它包括，试剂A和试剂B的体积比为1.8～2.2:1，所述的试剂A为钙黄绿素粉末和氯化锰粉末用去核酸酶水溶解，钙黄绿素浓度为600～650µM，氯化锰浓度为10～15mM；所述的试剂B为羟基萘酚蓝粉末用去核酸酶水溶解，浓度为13～17mM。2.根据权利要求1所述的用于LAMP可视化检测的混合染料，其特征在于：所述的试剂A中钙黄绿素的浓度为625µM，氯化锰的浓度为12.5mM；所述的试剂B中羟基萘酚蓝的浓度为15mM。3.LAMP扩增反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娟，庞博，赵超，宋秀玲，徐坤，王娟，牟颖，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22