本发明专利技术是关于一种蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，该抑制剂蛋白包括起抑制作用的多肽序列，和至少一段对所述蛋白酶具有特异性的底物－酶相互作用位点的多肽序列。本发明专利技术还提供了一种已分离纯化的ＤＮＡ序列，该ＤＮＡ序列编码所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白；一种特征在于其中含有所述已分离纯化的ＤＮＡ序列的表达载体；一种转化了所述表达载体的原核或真核宿主细胞；以及提供了一种制备嵌合抑制剂蛋白的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术是关于一种蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，该抑制剂蛋白包括起抑制作用的多肽序列，和至少一段对所述蛋白酶具有特异性的底物一酶相互作用位点的多肽序列。本专利技术的其它另外的目的是提供一种已分离纯化的DNA序列，该DNA序列编码所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白；提供一种特征在于其中包含所述已分离纯化DNA序列的表达载体；提供一种转化了所述表达载体的原核或真核宿主细胞；以及提供一种制备嵌合抑制剂蛋白的方法。
技术介绍
在活有机体表达的所有蛋白中，蛋白酶是其中调节细胞生死代谢途径的最关键蛋白。事实上，蛋白酶和底物最初的相互作用和随后的裂解，都以包括血栓形成、血凝固作用和细胞凋亡在内的广泛而重要的生物现象为基础。调节异常的蛋白酶解，或蛋白酶和抗蛋白酶的失衡可能是与蛋白酶有关的多种疾病(诸如癌症、自身免疫性疾病、炎症和感染性疾病)病理的关键因素。基于这样的猜想，对调节异常的蛋白酶解，或蛋白酶和抗蛋白酶的失衡进行了集中研究。在癌症和炎症疾病(例如风湿性关节炎和肺气肿)模型中对抗蛋白酶解药剂进行的不同研究也均表明，加强抗蛋白酶解的治疗和蛋白酶及抗蛋白酶的平衡作用，结果可以得到引人注意的改善。例如在美国人最常被诊断出的癌症前列腺癌中，一般认为蛋白酶在包括肿瘤迅速增殖、侵入和转移等肿瘤细胞的恶性表现中起重要作用。人类腺激肽释放酶(hK2)蛋白是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，主要在前列腺上皮中表达。最早从人精浆里分离的hK2目前已经成为前列腺癌的诊断标志(Deperthes等人，1995″Isolation of prostatic kallikrein hK2，alsoknown as hGK-1，in human seminal plasma″Biochim Biophys Acta，1245，311-6)。除作为诊断标志外，hK2的蛋白酶解活性表明hK2在癌症进程中起作用。现已提出该酶的几个潜在功能，包括尿激酶型血纤蛋白溶酶原激活物的活化作用和血纤蛋白溶酶原激活物抑制剂-1的灭活作用、前体前列腺特异抗原(pro-PSA)的活化作用、纤连蛋白的降解作用和胰岛素样生长因子结合蛋白的降解作用(IGF-BP)(详见Cloutier等人，2004″Development ofrecombinant inhibitors specific to human kallikrein 2 using phase-displayselected substrates″Eur J Biochem 3，607-13)。近来研究表明，在癌症特别是前列腺癌中，激肽释放酶hK2能与已知为蛋白酶抑制剂-6(PI-6)的蛋白酶抑制剂形成特异性复合体。基于对所述特异性复合体的发现，US 6284873和US 6472143提供了一种用于检测是否存在癌症或者有无组织坏死诊断方法。考虑到hK2的前列腺组织特异性表达和在癌症发展过程中其所有潜在底物的参与，也可以将hK2作为潜在的治疗靶标(Darson等人，1997″Humanglandular kallikrein 2(hK2)expression in prostatic intraepithelial neoplasia andadenocarcinomaa novel prostate cancer marker″Urology 49，857-62)。因此，开发特异性长效蛋白酶抑制剂，特别是激肽释放酶抑制剂会非常有用。所述蛋白酶抑制剂可以选自丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin)家族，该家族很大，是涉及调节复合体生理过程的蛋白质家族。所述蛋白的分子量在45千道尔顿左右，可以分成两组一组有抑制作用，另一组没有抑制作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂包括暴露的柔性反应位点环结构，或丝氨酸蛋白酶抑制剂反应环结构(RSL)，所述环结构涉及与推定的靶蛋白酶之间的相互作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂与所述靶蛋白酶结合，所述RSL的P1-P′1易裂键(P1-P′1scissile bond)断裂之后，形成一种新的共价络合物(Huntington等人，2000″Structure of a serpin-protease complex shows inhibition bydeformation″Nature 407，923-6)。所述络合物的形成诱发主要构象重排，并因此不可逆地捕获所述靶蛋白酶。所述丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制特异性主要归结于P1-P′1位点残基的属性和所述RSL的长度。改变RSL结构域或丝氨酸蛋白酶抑制剂的反应位点可以作为一种途径，用于推定丝氨酸蛋白酶抑制剂与靶蛋白酶之间的抑制过程，并用于开发特异性的抑制剂(Dufour等人，2001″The contribution of arginine residues within the P6-P1 region of alpha1-antitrypsin to its reaction with furin″J Biol Chem 276，38971-9和Plotnick等人，2002″The effects of reactive site location on the inhibitory properties of theserpin alpha(1)-antichymotrypsin″J Biol Claem 277，29927-35)。几种丝氨酸蛋白酶抑制剂如蛋白C抑制剂、α2抗纤溶酶、抗凝血酶-III、α1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、或蛋白酶抑制剂6，已经被鉴定为hK2的抑制剂(Saedi等人，2001″Human kallikrein 2(hK2)，but not prostate-specific antigen(PSA)，rapidly complexes with protease inhibitor 6(PI-6)released from prostatecarcinoma cells″Int J Cancer 94，558-63)。hK2和ACT之间形成络合物的速度相对较慢，主要归因于所述RSL的P1-P′1位点上的亮氨酸358-丝氨酸359(Leu 358-Ser 359)残基，和不利于所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的肽键。迄今为止，只公开了一些新的对血浆激肽释放酶特异性抑制的激肽释放酶抑制剂优选物及其在治疗和诊断方法中的应用(专利US 6057287、US6333402、US 5994125和US 5795865)。然而这些专利所描述的抑制剂制品与牛胰胰蛋白酶抑制剂的Kunitz结构域同源，尤其是与脂蛋白相关的促凝剂抑制物(LACI)的Kunitz结构域同源。所述Kunitz结构域特异性抑制血浆激肽释放酶。除了对血浆激肽释放酶有特异性外，这些抑制剂分子非常小，并以一种可逆的方式与血浆激肽释放酶结合。上述方法的主要缺点之一是，应用上述蛋白以可逆的方式抑制靶蛋白酶有一定风险，即所述靶蛋白酶经解络作用而恢复其活性。因此如这里所述，应用较大分子抑制剂的一个优点是形成以不可逆的方式抑制蛋白酶靶标的共价络合物。本专利技术的更大优点是众所周知，所述大型共价络合物能从循环中被快速消除。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是提供一种对所述蛋白酶具有高度特异性的蛋白酶抑制剂蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，该嵌合抑制剂蛋白包括： ａ）起抑制作用的多肽序列和 ｂ）至少一段对所述蛋白酶具有特异性的底物－酶相互作用位点的多肽序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：D德佩尔特，S克卢捷，
申请(专利权)人：洛桑大学，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]
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