能选择性杀伤癌细胞的ＲａｓＧＡＰ衍生肽制造技术

本发明专利技术涉及能增强药物选择性地杀伤细胞的能力的肽，它存在于ＲａｓＧＡＰ蛋白的Ｎ２序列，它的片段，或它的变体上。另外，本发明专利技术涉及药用组合物，作为活性物质，它包括药用有效量的所述肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能增强药物选择性地杀伤癌细胞能力的肽。另外，本专利技术涉及药用组合物，它包括作为活性物质的药用有效量的至少一种所述肽。
技术介绍
肿瘤是多样化的和不同种类的，不过，都具有不受控制地增殖的能力。不受控制的细胞增殖与受到抑制的细胞凋亡灵敏性相关，构成了发生肿瘤演变的最低要求。细胞凋亡是细胞进入编程的细胞死亡的过程，它是在发育过程中发生的一种重要现象，并且是保持体内平衡所必须的。被认为不可避免地让细胞进入细胞凋亡的生物化学事件是半胱氨酸蛋白酶(caspases，能裂解天冬氨酸残基后面的位点)的激活。发生细胞凋亡的细胞表现出特有的形态学和生物化学变化，包括细胞膜起泡，细胞变圆，染色质凝聚，DNA分裂，细胞凋亡标记在细胞表面上的表达，和抗-细胞凋亡信号的传导途径的抑制。所有这些事件都可能被特殊的半胱氨酸蛋白酶抑制剂抑制。因此，半胱氨酸蛋白酶底物的裂解决定了在细胞凋亡期间观察到的特殊特性变化的大部分(如果不是全部的话)。细胞凋亡的执行阶段是当半胱氨酸蛋白酶底物在细胞中被裂解时启动的。业已鉴定了多种半胱氨酸蛋白酶底物，并且这些底物的清单正在稳定的加长(Earnshaw W.C.等，“哺乳动物半胱氨酸蛋白酶结构，激活，底物，和在细胞凋亡期间的功能”Annu.Rev.Biochem.68，383，1999)。半胱氨酸蛋白酶底物一旦裂解，就会导致在细胞凋亡期间出现的生物化学和形态学事件，如半胱氨酸蛋白酶激活的放大，DNA分裂，细胞核降解等。另外，业已证实促细胞分裂剂-激活的蛋白激酶(MAPK)途径能以正面或负面的方式调控细胞凋亡(Jarpe M.B.等，“抗-细胞凋亡与促-细胞凋亡信号传导死亡途径上的检验点和终止信号”Oncogene，17，1475，1998；Widmann C.等，“促细胞分裂剂-激活的蛋白激酶从酵母到人类的三种激酶模块的保守性”Physiol.Rev.79，143，1999)。这可以解释所述细胞凋亡半胱氨酸蛋白酶为什么靶定调控MAPK的某些信号传导蛋白和/或是MAPK途径的成分(Widmann C.等，“在细胞凋亡期间半胱氨酸蛋白酶-决定型信号蛋白的裂解。抗-细胞凋亡信号的支路机制”J.Biol.Chem.，273，7141，1998)。所述蛋白包括MEKK1，PAK2，Mst1和RasGAP。最近，Yang和Widmann(Yang J.-Y.和Widmann C.，“通过半胱氨酸蛋白酶-诱导的RasGAP裂解产生的抗细胞凋亡信号”Mol.Cell.Biol.，21，5346，2001；“一种类型的半胱氨酸蛋白酶底物起着细胞凋亡的两种不同面目的作用”Eur.Cytokine Netw.，13，387，2002a；“通过半胱氨酸蛋白酶裂解产生的RasGAP N-末端片段能以Ras/PI3K/Akt-决定型方式保护细胞，它不取决于NFκB”J.Biol.Chem.，277，14641，2002b)业已证实了RasGAP，和Ras和Rho GTP-结合蛋白的调节剂是不常见的半胱氨酸蛋白酶底物，因为它可以诱导抗-和促-细胞凋亡信号，这取决于它对半胱氨酸蛋白酶裂解的程度。它们业已证实，在低水平的半胱氨酸蛋白酶活性下，RasGAP在455号位置上裂解，产生N-末端序列(序列N)和C-末端序列(序列C)。序列C，而不完整长度的RasGAP在HeLa细胞中诱导了强的细胞凋亡反应，正如通过它诱导固缩细胞核的出现，半胱氨酸蛋白酶3的激活，和PARP的裂解能力所证实的。在同一项研究中，作者还证实了序列N，不是促进细胞死亡，而似乎是半胱氨酸蛋白酶激活的细胞凋亡下游的通用抑制剂。在较高水平的半胱氨酸蛋白酶活性上，序列N阻碍细胞凋亡的能力当它在157号位置上被裂解时受到抑制。后一种裂解事件产生两种序列，N1和N2，这些序列与序列N不同，业已证实能使细胞敏化，它可以产生向细胞凋亡发展的高的半胱氨酸蛋白酶活性，它是通过顺氯氨铂诱导的，这是用于化疗的治疗癌症的药物。不过，Leblanc等(Leblanc V.等，“Ras-GTPase激活了蛋白抑制剂，特别是诱导肿瘤细胞的细胞凋亡的蛋白抑制剂”Oncogene，18，4884，1999)业已证实注射针对RasGAP的N2序列的SH3结构域的单克隆抗体，以便抑制这种蛋白，在癌细胞中专一性地诱导了细胞凋亡。从专利申请WO99/65947(Parker等)中还了解到针对RasGAP SH3-结构域-结合蛋白，G3BP的单克隆抗体，在癌细胞中诱导了细胞凋亡。其中，G3BP是专一性地超量表达的。以上结果似乎表明，RasGAP途径通过RasGAP SH3结构域调控生长，它是某些癌细胞存活所必须的。以上发现似乎与Yang和Widmann获得的结果相反，并因此得出这样的结论，RasGAP SH3结构域在细胞中诱导和调控细胞凋亡的功能方面具有相当矛盾的功能。化疗本身或与其他治疗(例如放射治疗)的组合是目前用来治疗癌症的最常见的和最有效的治疗工具之一。用于治疗癌症的化疗中的药物的效力取决于它们杀伤癌细胞的能力。不过，这些药物的使用存在限制，原因是，它们还可能对正常细胞，非癌细胞产生负面影响，因为它们不仅能在癌细胞中诱导强的半胱氨酸蛋白酶刺激，而且还能在正常细胞，非癌细胞，特别是快速分裂的细胞中诱导这种作用。因此，对临床医生提出的挑战是选择药物的剂量，该剂量要高大到足以消除肿瘤，而且又不会高到在患者体内诱导严重的副作用，如脱发，恶心和呕吐，心脏毒性和继发性癌症。改善药物对癌细胞的选择性，显然能加强化疗治疗的效力，从而可以使用较低剂量的药物，由此还可导致尽可能地降低上面所列举的严重的副作用。因此，本专利技术的目的是提供改善了的方法，它与药物组合用于治疗或预防癌症，它不具有上述缺陷。
技术实现思路
这一目的业已通过提供主要包括RasGAP蛋白的N2序列的肽，它的片段，或它的变体而实现，它能增强药物选择性地杀伤癌细胞的能力。另外，本专利技术提供了编码所述肽的纯化的和分离的核酸序列，包括至少一个拷贝的纯化的和分离的核酸序列的表达载体，和包括所述肽的真核或原核宿主细胞，分离的和纯化的核酸序列和/或所述表达载体。本专利技术还提供了药用组合物，它包括药用有效量的至少一种本专利技术的肽作为活性物质。附图说明图1表示通过各种药物在用片段N2或空的pcDNA质粒转染过的HeLa细胞中细胞凋亡诱导的百分比。将HeLa细胞(2×106)铺平到直径为10-cm的陪替氏培养皿中，用1μg的GFP-表达质粒(标记转染过的细胞)与2μg的空的pcDNA3质粒或2μg的编码片段N2的pcDNA3载体一起转染。在转染一天之后，用所标浓度的顺氯氨铂，阿霉素或米托蒽醌培养细胞24小时。然后统计表现固缩的细胞核的GFP-阳性细胞的数量。结果反映出三次独立测定的平均值±标准误差。星号表示对照细胞和用顺氯氨铂处理过的细胞之间的显著差异(*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001)。图2A是用于本研究的不同构建体的示意图。SH表示Src同源结构域。图2B表示在用编码图2A所示构建体的质粒转染的HeLa细胞中通过顺氯氨铂诱导的细胞凋亡诱导的百分比。按图1所示用编码图2A所示的构建体的质粒转染HeLa细胞。然后用0.15μM顺氯氨铂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能增强药物杀伤细胞的能力的肽，其特征在于，所述肽主要包括ＲａｓＧＡＰ蛋白的Ｎ２序列，它的片段，或它的变体，它能选择性地增强在癌细胞中的所述能力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯蒂安威德曼，杨江阳，戴维米乔德，
申请(专利权)人：洛桑大学，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]