由正常人皮肤组织衍生的无限增殖细胞系制造技术

本发明专利技术涉及经由至少一种逆病毒衍生的功能性致瘤基因无限增殖化的人角质细胞细胞系，该细胞系具有如下特点（１）非致瘤的，（２）即使在组织培养中高速率传代之后仍保留分化及表达正常分化的角质细胞表达的蛋白和酶的特性，以及（３）在无血清培养基和无饲养细胞层时进行器官型培养，形成包括正常角质角质层（Ｓｔｒａｔｕｍ Ｃｏｒｎｅｕｍ）的复层极化上皮。本发明专利技术还涉及无限增殖化人皮肤细胞获得无限增殖的角质细胞的改进方法，该方法的特点在于它包括用至少两种不同逆病毒的功能性致瘤基因感染角质细胞的步骤。本发明专利技术进一步涉及所述角质细胞应用于免疫的，药理学的。光毒理学和化学毒理学皮肤反应，表达异源基因及构建人造皮肤的应用。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及由正常人皮肤组织衍生的新的无限增殖的细胞系，该细胞系具有改善的分化特性，涉及制备这些细胞系的新方法及其应用，尤其在创造人工皮肤的领域。技术状况从正常人皮肤组织衍生的无限增殖细胞系的制备已有过描述。一般地，为此目的方法包括人皮肤细胞的转化，例如角质细胞和黑色素细胞，在体外培养加入传送无限增殖化的试剂。无限增殖化涉及细胞的生产，细胞可在体外长期培养，理论上为无限时期。这些细胞也命名为传代细胞系(连续细胞系)。与之对照，非无限增殖的细胞体外仅能在有限次数细胞分裂过程中增殖。无限增殖化细胞非常有益，因其提供具有一定特性的稳定的，假定无限的细胞来源，无限增殖化细胞系和无限增殖化人皮肤细胞系的制备用的典型药剂特别包括，例如病毒、重组病毒和包含传送无限增殖化特性的DNA序列的质粒。无限增殖的人细胞系制备的最普通方法包括猿猴病毒40(SV40)的序列和更具体的SV40的大T抗原(T-Ag)的DNA作为无限增殖化试剂的应用。例如，Steinberg等，细胞生理学，123,117-125(1985);US4885238(Reddel等);US4707448(Major);stoner等.，癌症研究.,51,365-371(1991);Chopra等.,体外细胞发育生物学.,30A,539-546(1994);Chopra等.,体外细胞发育生物学，27A,763-765(1991);Christian等.,癌症研究47,6066-6073(1987);Rhim等.,科学，227,1250-1252(1985);和Grubman等.，胃肠，肝脏生理病理学，29,G1060-G1070(1994)报道了SV40载体及含SV40大T抗原的序列的载体在制备无限增殖的人细胞系中的应用。这些序列的引入一般通过SV40病毒或12/SV40杂交腺病毒感染或包括劳斯肉瘤病毒的长末端重复和调节SV40起始区的重组质粒经磷酸锶存在下的共沉淀进行细胞转化而实现。(见Brash等.，分子细胞生物学，7,2031-2034,1987)另一个已知的无限增殖化细胞系，特别是无限增殖的人角质细胞的制备方法包括以人乳头瘤病毒(HPV)的DNA序列对细胞的转化或感染。例如，US5376542(Schlegel)描述了采用HPV-16,18,31,33或35分离的E6和E7基因或仅E7基因对人上皮细胞无限增殖化，制备非致瘤的无限增殖的人细胞系。此外，Barbosa等，癌基因，4,1529-1532(1989)；和Münger等，病毒学杂志，63(10):4417-4421(1989)报道了HPV-16和HPV-18的E6和E7基因制备无限增殖的人角质细胞的应用。此外，Dürst等.，癌基因，1,251,256(1987)描述使用乳头状瘤病毒型16进行的角质细胞的无限增殖化。尽管如此，众多的小组描述了无限增殖的角质细胞系及它们在体外试验中的应用，本领域确定的无限增殖的角质细胞系通常呈现它们利用不便之外的一或更多特性。例如，以往描述的无限增殖的角质细胞呈现以下特性的一或更多种(ⅰ)分化标志物的表达的减少或丢失，例如由正常分化角质细胞表达的蛋白，(ⅱ)组织培养中生长特性的改变和(ⅲ)形成具有角化不全角质层的复层极化上皮。为消除这些缺陷，EP 780496(Société des Produits Nestlé)提出无限增殖化角质细胞或人黑色素细胞的新方法，使用en sus新培养基，从SV40病毒衍生的载体PLXSHD+SV40(#328)，或从人乳头状瘤病毒16(HPV-16)衍生的同等载体PLXSHD+E6/E7。由此方式获得的无限增殖的细胞保留分化的能力以及表达正常分化的角质细胞和黑色素细胞表达的蛋白和酶的能力，即便在培养中多次传代之后。但是，除以上描述之外，在应用领域还需要具更多改良特性的无限增殖的角度细胞。这样的细胞对许多应用非常有益，尤其是对需要高度分化皮肤细胞的分析。本专利技术的另一目的在于提供制备来源于正常皮肤组织无限增殖化的角质细胞系的新方法。而且，本专利技术的另一目的在于提供根据本专利技术的应用这些角质细胞系的方法，例如对皮肤反应的免疫学的，药理学的，和化学毒理分析，以及异源基因的表达。图2表示由乳头状瘤病毒16的逆病毒衍生的，称为质粒PLXSHD+E6/E7的结构，该质粒用于无限增殖化本专利技术的角质细胞。专利技术详述本专利技术提供非致瘤性的，无限增殖的角质细胞系，即当对一种动物皮下注射至少2×106细胞时不形成肿瘤的细胞系。该细胞系在多次传代后仍保持分化和表达正常角质细胞表达的分化蛋白的能力。词句“多次传代”意味着培养中至少10次传代，优选至少20至30次传代，更优选至少50次传代，理论上无限次数传代。例如，根据本专利技术制备的无限增殖的角质细胞在组织培养中多次传代后表达包括角蛋白K1/10，角蛋白K14外皮蛋白(involucrine)，filaggrine和兜甲蛋白。本专利技术的无限增殖的角质细胞具有与正常角质细胞相似的，如果不是完全相同，细胞色素p450的分布图。例如，本专利技术的细胞表达CYP450 1A1,2E1,2C18和3A5。此外，本专利技术的无限增殖角质蛋白表达Ⅱ期的酶，例如谷胱甘肽-S转移酶π(GSTπ)，方式与正常，非无限增殖的角质细胞相当。此外，本专利技术的无限增殖的角质细胞表达在细胞氧化和炎症反应时表达的蛋白和酶，例如，佛波酯处理后的超氧化物歧化酶(SOD)和Ⅰ型胶原酶和肿瘤坏死因子(TNFα)，以与正常分化角质细胞相似或相同的方式表达。由于具备了上述特征，该细胞系代表对皮肤反应免疫学，药理学，炎症，光和化学毒理学研究的非常有趣的，能复制的来源。此外，本专利技术的无限增殖角质细胞系，如果在无血清培养基且无滋养层细胞(无成纤维细胞)时进行器官型培养，复层和极化的上皮具有表面角化层，一般所谓的角质层具有正常角质细胞形态学，说明角质层丧失有核细胞，即包含核的细胞。使用无限增殖角质细胞制备复层和极化上皮，以往都在标准培养条件下进行，即通过使用含小牛血清的培养基和滋养细胞层的技术(Lechner等，病毒学，185,536-571,1991)。尽管如此，无限增殖的细胞不形成正常表面角化层。例如，乳头状瘤病毒16或18，或E6/E7无限增殖化的细胞系，形成非常杂乱的上皮(Blanto等.，美国病理学杂志.，138,673-685,1991;Hudson等.，病毒学杂志.，64,519-526,1990;McCane等.，美国国家科学院进展85,7169-7173,1988,Woodworth等.，癌基因7,619-626,1992)与之对照，EP780496(Société des Produits Nestlé)描述的细胞系，如果在无血清且无滋养细胞层条件下进行器官型培养，形成具有正常表面角质层的复层极化上皮，尽管具有角化不全角质细胞形态学，该角质层细胞仍具核。本专利技术的无限增殖角质细胞还吸收外源的必需脂肪酸(AGE)，呈现出和正常角质细胞的不饱和状态和链的延长极其对应的不饱和状态和AGE链的延长。一般地，本专利技术的无限增殖细胞可根据如下方法获得(ⅰ)获取人皮肤样本；(ⅱ)制备皮肤样本从而获得能培养的原代角质细胞；(ⅲ)在无血清培养基中培养原代角质细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由至少一种逆病毒来源的功能性肿瘤基因无限增殖化的人角质细胞系，具有如下特点：（ｉ）非致瘤性的；（ｉｉ）即使在多次传代后仍保有分化能力和表达正常分化的角质细胞表达的酶和蛋白质的能力；以及（ｉｉｉ）当在无血清培养基中且无滋养层细 胞进行器官型培养时，形成具角质层正常角质细胞的复层极化上皮。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M保尔，
申请(专利权)人：雀巢制品公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]