在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子的方法技术

本发明专利技术提供了一种在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子的方法，其包括如下步骤：(1)构建重组猪EGF表达载体；(2)用重组质粒pJ912‑pEGF电转化毕赤酵母X‑33；(3)生物发酵表达猪EGF。本发明专利技术的方法能够在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子。

Efficient expression of Recombinant Porcine Epidermal growth factor in Pichia pastoris

The present invention provides a method for Recombinant Porcine Epidermal growth factor expression in Pichia pastoris, which comprises the following steps: (1) to construct the recombinant expression vector of porcine EGF; (2) using the recombinant plasmid pJ912 pEGF transformed Pichia pastoris X 33; (3) the expression of porcine EGF fermentation. The method of the present invention can express recombinant porcine epidermal growth factor efficiently in Pichia pastoris.

【技术实现步骤摘要】
在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子的方法。
技术介绍
表皮生长因子(Epidermalgrowthfactor,EGF)是许多哺乳动物中存在的一种由53个氨基酸组成的促细胞有丝分裂多肽。EGF能促进蛋白及DNA的合成、细胞的增殖和分化。临床应用上，EGF对人和动物肠道健康有重要作用，有助于保护肠道屏障的完整性，有利于肠道发育，维持小肠上皮细胞稳态，促进仔猪胃肠上皮细胞的成熟，降低断奶仔猪的应激，提高断奶仔猪的免疫功能，是有效的肠道调节剂。此外，EGF能刺激静止期猪卵母细胞的成熟，加速卵子的排出，提高母猪的繁殖率。因此，猪EGF在畜牧业发展中有重要的应用前景。动物内源性EGF分泌量少不能满足机体的需求，目前运用生物技术表达外源性EGF的工程菌有大肠杆菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母。实际生产应用中，对于生产生物蛋白产品基因工程菌的要求为，遗传背景清晰，遗传性质稳定，易于基因操作，培养成本低，产量高，无毒副产品。毕赤酵母具有已经商业化，较为成熟的表达系统。但目前报道使用酵母表达EGF的浓度较低，仅为30mg/L(Wangetal.,2014)，因此，急需更为高效的酵母表达系统满足大规模生产需求。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的不足，提供一种能够在毕赤酵母中高效地表达重组猪表皮生长因子的方法。为此，本专利技术提供了如下技术方案。一种在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子的方法，所述方法包括如下步骤：(1)构建重组猪EGF表达载体pJ912-pEGF：人工合成猪EGF核苷酸序列，在所述猪EGF核苷酸序列的5’端和3’端分别加入SmalI和PstI酶切位点，得到猪EGF合成产物，用SmalI和PstI双酶切表达载体pJ912并进行回收，将回收后的表达载体pJ912与所述猪EGF合成产物用T4DNA连接酶连接以构建重组质粒pJ912-pEGF；(2)用重组质粒pJ912-pEGF电转化毕赤酵母X-33：将重组质粒pJ912-pEGF的DNA用SwaI酶切，线性化，用苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法进行纯化；纯化后的线性质粒DNA溶解于10ul无核酸酶水中；再用纯化后的线性质粒DNA电转化毕赤酵母X-33；得到重组子。(3)生物发酵表达猪EGF。优选地，所述猪EGF核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述表达载体pJ912含有SmalI和PstI酶切位点、AOX1启动子、α因子分泌信号序列。优选地，所述步骤(2)中，电转化时使用的电比色皿宽0.4cm，电转化的条件为：电压1.5kv，电击4ms。进一步，电击过程在冰上进行。优选地，所述步骤(2)还包括将所述重组子涂布于YPD琼脂培养基平板上筛选。更优选地，所述YPD琼脂培养基的成分为1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％琼脂、1M山梨醇和100ug/ml博来霉素。优选地，所述步骤(2)还包括用以下引物对所述重组子进行PCR扩增筛选，筛选出阳性重组子；所述引物序列如下：上游引物:5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’，下游引物：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。优选地，在小规模生物发酵表达猪EGF中，所述步骤(3)的生物发酵表达条件为：甘油培养温度为30℃，甲醇诱导温度为25℃，甲醇诱导体积浓度为1％，pH值为5.5。优选地，在大规模生物发酵表达猪EGF中，所述步骤(3)的生物发酵表达条件为：甘油培养温度为30℃，甲醇诱导温度为26℃，甲醇体积浓度为2％，pH值为5.5。与现有技术相比，本专利技术的方法能够实现在毕赤酵母中更高效地表达重组猪表皮生长因子。附图说明图1为重组表达质粒pJ912-pEGF的构建图。图2为PCR检测阳性重组毕赤酵母的结果。图3为用蛋白质印迹法比较不同猪EGF拷贝数重组酵母中猪EGF表达量的结果。图4为用蛋白质印迹法检测重组酵母菌株不同发酵时间猪EGF表达量的结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案进行说明，应当理解，此处描写的实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。1、猪表皮生长因子EGF基因的获得：根据猪EGF氨基酸序列及毕赤酵母密码子偏好性对猪EGF核苷酸序列进行密码子优化，优化后的猪EGF核苷酸序列(SEQIDNO.1)为：5’-AACTCCTATTCAGAATGCCCTCCATCTCACGATGGTTACTGTTTGCATGGTGGAGTCTGCATGTACATCGAGGCAGTGGATAGCTATGCTTGTAATTGTGTATTCGGATACGTTGGTGAAAGATGTCAACATCGTGACTTGAAATGGTGGGAACTGAGGTAGTAA-3’。在优化好的猪EGF核苷酸序列5’端和3’端分别加入SmalI和PstI酶切位点，人工合成该核苷酸序列。2、重组表达质粒pJ912-pEGF的构建：表达载体pJ912含有SmalI和PstI酶切位点、AOX1启动子、α因子分泌信号序列。用SmalI和PstI双酶切表达载体pJ912并进行回收，回收后的表达载体pJ912和上述合成产物用T4DNA连接酶连接，以构建重组质粒pJ912-pEGF。用重组质粒pJ912-pEGF电转化E.coli5α感受态细胞。用双酶切鉴定和测序检测阳性重组质粒。图1为重组表达质粒pJ912-pEGF构建图，其中SS为α因子分泌信号。3、表达猪EGF重组毕赤酵母菌的构建筛选出的阳性重组质粒DNA用SwaI酶切、线性化、用苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法进行纯化。纯化后的线性质粒DNA溶解于10ul无核酸酶水中。纯化后的阳性重组质粒电转化毕赤酵母X-33。电击转化时使用的电比色皿宽0.4cm，电击转化的条件为：电压1.5kv，电击4ms。电击过程在冰上进行。之后，涂布于YPD琼脂培养基平板上筛选，YPD琼脂培养基成分包括1重量％酵母提取物、2重量％蛋白胨、2重量％琼脂、1M山梨醇和博来霉素(100ug/ml)。挑取YPDZ平板上的克隆子，采用菌落PCR的方法验证。PCR时使用的引物序列为：上游引物:5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’,(SEQIDNO.2)下游引物5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。(SEQIDNO.3)图2为PCR检测阳性重组pEGF毕赤酵母基因组DNA的结果，其中，EGF-G418核苷酸序列的理论长度为562bp。4、高拷贝高表达猪EGF重组酵母菌株的筛选：由于用博来霉素筛选高拷贝猪EGF重组酵母菌株结果不理想，将猪EGF克隆至含有G418抗生素抗性标记表达系统。重组酵母克隆在不同G418抗生素浓度中进行筛选。用实时定量PCR确定整合的猪EGF拷贝数。重组酵母细胞在传代5次后还维持各自的猪EGF拷贝数。用Western-blot检测高拷贝猪EGF重组酵母菌株的猪EGF表达量，如图3所示，结果显示拷贝数与表达量之间有一定的联系(见表1)。当EGF拷贝数小于7时，拷贝数与EGF表达量成正比，当EGF拷贝数大于7时，表达量不再显著增加。表1qPCR方法鉴定不同重组酵母克隆中猪EGF的拷贝数pPEGF-G418克隆子编号试验1检测拷贝数试验1检测拷贝数6410本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子的方法，其包括如下步骤：(1)构建重组猪EGF表达载体pJ912‑pEGF：人工合成猪EGF核苷酸序列，在所述猪EGF核苷酸序列的5’端和3’端分别加入SmalI和PstI酶切位点，得到猪EGF合成产物，用SmalI和PstI双酶切表达载体pJ912并进行回收，将回收后的表达载体pJ912与所述猪EGF合成产物用T4DNA连接酶连接以构建重组质粒pJ912‑pEGF；(2)用重组质粒pJ912‑pEGF电转化毕赤酵母X‑33：将重组质粒pJ912‑pEGF的DNA用SwaI酶切，线性化，用苯酚‑氯仿抽提和乙醇沉淀法进行纯化；纯化后的线性质粒DNA溶解于10ul无核酸酶水中；再用纯化后的线性质粒DNA电转化毕赤酵母X‑33；得到重组子。(3)生物发酵表达猪EGF。

【技术特征摘要】
1.一种在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子的方法，其包括如下步骤：(1)构建重组猪EGF表达载体pJ912-pEGF：人工合成猪EGF核苷酸序列，在所述猪EGF核苷酸序列的5’端和3’端分别加入SmalI和PstI酶切位点，得到猪EGF合成产物，用SmalI和PstI双酶切表达载体pJ912并进行回收，将回收后的表达载体pJ912与所述猪EGF合成产物用T4DNA连接酶连接以构建重组质粒pJ912-pEGF；(2)用重组质粒pJ912-pEGF电转化毕赤酵母X-33：将重组质粒pJ912-pEGF的DNA用SwaI酶切，线性化，用苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法进行纯化；纯化后的线性质粒DNA溶解于10ul无核酸酶水中；再用纯化后的线性质粒DNA电转化毕赤酵母X-33；得到重组子。(3)生物发酵表达猪EGF。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述猪EGF核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述表达载体pJ912含有SmalI和PstI酶切位点、AOX1启动子、α因子分泌信号序列。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李巨浪，伊芬娜，刘璨颖，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：广东,44