从多个引物测序以增加数据速率和密度制造技术

本发明专利技术涉及测序方法，其允许增加的测序速率和增加的测序数据密度。该系统可基于如合成测序(SBS)的下一代测序方法，但使用多个在相同核苷酸链的不同位置处结合的多个引物。

Multiple primers are sequenced to increase data rate and density

The present invention relates to sequencing methods that allow increased sequencing rates and increased sequencing data density. The system can be based on next generation sequencing methods such as synthetic sequencing (SBS), but uses multiple primers that bind at different positions of the same nucleotide chain.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从多个引物测序以增加数据速率和密度本专利技术涉及允许增加的测序速录和增加的测序数据密度的测序方法。系统可以基于如合成测序(sequencingbysynthesis)(SBS)的下一代测序方法，但使用多个在相同核苷酸链的不同位置处结合的多个引物。破译DNA序列对于生物研究的几乎所有分支都至关重要。随着Sanger测序的出现，科学家获得了从任何给定的生物系统中阐明遗传信息的能力。该技术已经在世界各地的实验室得到广泛应用，但一直受到通量、可扩展性、速度和分辨率的固有限制的阻碍，这些限制通常阻碍了科学家获得所需的基本信息。为了克服这些障碍，开发了下一代测序(NGS)，其引发了许多突破性的发现并引发了基因组学科学中革命的根本不同的测序方法。下一代测序数据输出最初以超过摩尔定律的速度增长，自其专利技术以来每年的增长都超过一倍。2007年，单次测序运行最多可产生大约一千兆碱基(Gb)数据。到2011年，这一速率在单次测序运行中几乎达到了terabase(Tb)数据，几乎在4年中增加了1000倍。凭借快速生成大量测序数据的能力，下一代测序使研究人员可以在几小时或几天内从想法快速移动到完整的数据集。研究人员现在可以在单次运行中测序16个人类基因组，大概3日内生成数据，而每个基因组的试剂成本仍在下降。相比之下，第一个人类基因组使用CE技术进行测序需要大约10年并用额外的3年来完成分析。完成的项目于2003年发布，仅在专利技术下一代测序的前几年，并且带来的价格标签接近30亿美元。虽然最新的高通量测序仪器能够进行大量数据输出，下一代测序技术是高度可扩展的。同样的基础化学可用于较低产率的目标研究或较小的基因组。这种可扩展性给出了研究人员设计最适合其特定研究需求的研究的弹性。为了测序小细菌/病毒基因组或目标区域(如外显子)，研究人员可以选择使用较低输出的仪器，并且每次运行处理较少数量的样品，或者可以选择通过在高通量仪器上进行多路复用(multiplexing)来处理大量样品。多路复用可以在单个实验期间同时测序大样本数。虽然下一代测序显著提高了产率，当例如处理大型基因组时，提高测序数据速率和密度仍是有利的。本专利技术旨在进一步改善数据速率和数据密度/产率，特别是当适用于下一代测序/合成测试(SBS)方法时。优选地，术语“碱基调用(basecall)”指将碱基(核碱基)分配至测序期间获得的信息的过程，例如通过将核苷酸分配至色谱峰。如本文所用，并且除非另有说明，以下每个术语的定义应当如下。●A--腺嘌呤；●C-胞嘧啶；●DNA--脱氧核糖核酸；●G--鸟嘌呤；●RNA--核糖核酸；●T--胸腺嘧啶；和●U--尿嘧啶。“核酸”将意指任何核酸分子，包括但不限于DNA、RNA和其杂合体。形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U，以及它们的衍生物。这些碱基的衍生物是本领域熟知的，并且示例于PCR系统，试剂和消耗品中(PerkinElmerCatalogue1996-1997,RocheMolecularSystems,Inc.,Branchburg,N.J.,USA)。核苷酸的“类型”指A、G、C、T或U。“质量标签”将意指预定大小的分子实体，其能够通过可切割键连接到另一实体。“固体基底”将意指存在于固相的介质，其中抗体或试剂可以附接(affix)至所述固相。在提供一系列数值的情况下，可以理解，除非上下文另有明确规定，每个干预值，到下限单位的十分之一，在该范围的上限和下限之间，以及在该范围内的任何其他规定或干预值，包含在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也包括在本专利技术中，在规定的范围内受到任何明确排除的限制。如果所述范围包括一个或两个限制，本专利技术也包括排除了那些包括的限制中的一个或全部的范围。本专利技术的一个方面提供了一种测定核酸序列的方法，其包括提供与支持物结合的至少一个核酸；将至少两个引物与核酸的相同链杂交；在所述至少两个引物中的每个处在所述核酸的相同链上进行引物延伸；获得对应于每次引物延伸时掺入的至少一个核苷酸碱基的信号数据；从所述信号数据测定所述核酸碱基的身份并将所述碱基分配至延伸读段。优选地，所述方法包括在允许杂交的条件下在存在下列各项的情况下将所述核酸与酶接触以给出多个延伸读段，每个延伸读段从所述至少两个引物之一延伸：(i)能够在不同位置处与所述核酸的相同链杂交的至少两个引物，和(ii)四个标记部分(labelledmoieties)，其包含至少一个选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的核苷酸类似物，所述四个标记部分的每个具有不同于其他三个标记部分的独特标记物的独特标记物。所述方法可以包括除去未结合的标记部分的步骤。优选地，多个延伸读段包含基本同时的延伸读段。在某些实施方案中，四个标记部分各包含选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的单一可逆终止核苷酸类似物或可逆终止剂类似物或者包含至少一个选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的核苷酸类似物的寡核苷酸探针。有利地，可以基本上同时获得对应于所述至少两个引物延伸中每个的所述信号数据。这提供了优势，即信号数据包含对应于来自相同核酸链的多个信号的数据。任选地，信号数据包含一个或多个图像。任选地，信号数据以对应于所述引物延伸上掺入的多个核苷酸类似物的颜色信号检测，并且其中每个颜色信号对应于不同核苷酸类似物或核苷酸类似物的组合。本专利技术的一个方面提供了用于测定核酸序列的方法，其包括进行以下步骤：(a)提供至少一个与支持物结合的核酸；(b)在允许杂交的条件下在存在下列各项的情况下将所述核酸与酶接触以给出多个延伸读段，每个延伸读段从所述至少两个引物之一延伸：(i)能够在不同位置处与所述核酸的相同链杂交的至少两个引物，和(ii)四个标记部分，其包含至少一个选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的核苷酸类似物，所述四个标记部分的每个具有不同于其他三个标记部分的独特标记物的独特标记物。(c)除去未结合的探针；(d)通过测定对应独特标记物的身份来测定掺入步骤(b)中的核酸类似物的身份，以及(e)将核苷酸碱基分配至延伸读段。优选地，所述多个延伸读段包含同时延伸读段。在某些实施方案中，所述方法包括合成测序和酶包含聚合酶。四个探针的每个可以包含选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的单个可逆终止核苷酸衍生物或可逆终止剂类似物。在某些实施方案中，所述方法包括通过连接测序并且所述酶包含连接酶。所述四个探针可以包含寡核苷酸。所述寡核苷酸可以是用于通过连接技术测序的类型。所述方法可以包括合成测序、通过连接测序、焦磷酸测序或纳米孔测序。在某些实施方案中，每个独特标记物可检测为不同的颜色。有利地，因为两个或更多个引物与核酸的相同链在不同位置处杂交，这允许链的测序开始于两个不同的位点，以给出多个延伸读段，潜在地倍增了数据的密度和其获得的速率。当系统使用结合固体支持物的核酸时(例如在下一代测序技术中)，这允许在每个特定位置处制造出多个碱基调用。将每个碱基调用分配至正确延伸读段，这允许测定核酸序列。在某些实施方案中，该方法提供的优势在于可以实时同时鉴定在相同链上的不同位置处掺入核酸的单个模板链的多个核苷酸碱本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于测定核酸序列的方法，其包括：提供与支持物结合的至少一个核酸；将至少两个引物与核酸的相同链杂交；在所述至少两个引物中的每个处在所述核酸的相同链上进行引物延伸；获得对应于每次引物延伸时掺入的至少一个核苷酸碱基的信号数据；从所述信号数据测定所述核酸碱基的身份并将所述碱基分配至延伸读段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.05 GB 1419731.31.用于测定核酸序列的方法，其包括：提供与支持物结合的至少一个核酸；将至少两个引物与核酸的相同链杂交；在所述至少两个引物中的每个处在所述核酸的相同链上进行引物延伸；获得对应于每次引物延伸时掺入的至少一个核苷酸碱基的信号数据；从所述信号数据测定所述核酸碱基的身份并将所述碱基分配至延伸读段。2.权利要求1的方法，其中所述方法包括在允许杂交的条件下在存在下列各项的情况下将所述核酸与酶接触以给出多个延伸读段，每个延伸读段从所述至少两个引物之一延伸：(i)能够在不同位置处与所述核酸的相同链杂交的至少两个引物，和(ii)四个标记部分(labelledmoieties)，其包含至少一个选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的核苷酸类似物，所述四个标记部分的每个具有不同于其他三个标记部分的独特标记物的独特标记物。3.权利要求2的方法，其中所述方法包括除去未结合的标记部分的步骤。4.权利要求2或3的方法，其中所述多个延伸读段包含基本同时的延伸读段。5.权利要求2至4中任一项的方法，其中所述四个标记部分各包含选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的单一可逆终止核苷酸类似物或可逆终止剂类似物或者包含至少一个选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的核苷酸类似物的寡核苷酸探针。6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述酶包含聚合酶或连接酶。7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述支持物包含芯片或珠。8.权利要求2至7中任一项的方法，其中所述独特标记物包含染料、荧光团、生色团、组合荧光能量转移标签、质量标签，或电泳团(electrophore)。9.前述权利要求中任一项的方法，其中至少两个引物具有重叠序列。10.前述权利要求中任一项的方法，其中至少两个引物相差单个碱基添加。11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多个引物包含封闭和未封闭的引物以化学区分每个延伸读段。12.前述权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：JM鲍特尔，
申请(专利权)人：伊卢米纳剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB