定量监测造纸厂或制板厂的含水环境中的内生孢子的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于定量监测造纸厂或制板厂的含水环境中的细菌内生孢子的方法。该方法包括至少以下步骤：获得来自工业含水环境的至少第一含水样品；通过适当处理，优选通过将第一样品加热至所期望温度来破坏第一样品中的细菌繁殖体；向经处理的第一样品加入插入剂(如PMA)并使其与被破坏的细菌相互作用(例如，通过交联)，使得来自破坏的细菌的核酸不可用于PCR；和通过使用定量聚合酶链反应(qPCR)来测定第一样品中的内生孢子水平(其中仅来自内生孢子的DNA可用于扩增)。

Method for quantitative monitoring of spores in water environment of paper mill or plate mill

The present invention relates to a method for the quantitative monitoring of bacterial spores in an aqueous environment of a paper mill or a board mill. The method comprises the following steps: obtaining at least at least the first water samples from industrial water environment; after proper treatment, preferably by the first sample is heated to the desired temperature to destroy bacteria first in the sample; adding to the first sample processed into the agent (such as PMA) and the destruction of the bacteria to each other function (e.g., by crosslinking), makes the damage of nucleic acid from bacteria is not available for PCR; and by using quantitative polymerase chain reaction (qPCR) to determine the first samples of endospores level (from which only endosporic DNA can be used for amplification).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】定量监测造纸厂或制板厂的含水环境中的内生孢子的方法本专利技术涉及一种定量监测根据所附权利要求的前序部分的造纸厂或制板厂的含水环境中的内生孢子的方法。细菌细胞通常存在于造纸厂和制板厂的含水环境中。通常通过使用各种措施例如将杀生物剂注入到工艺中来监测和限制工艺中的细菌生长。然而，某些细菌细胞形成内生孢子，其高度耐受诸如加热、消毒剂、化学杀生物剂、干燥剂、紫外光和电离辐射的通常的细菌破坏方法。内生孢子能够在长时间甚至数年保持成活和休眠直到外部条件变得有利，此后发生细菌内生孢子的转化，即萌发。尤其是在纸巾和食品和/或饮料包装纸板的生产中，最终产品的卫生级别是特别重要的。最终产品不应包含高水平的细菌内生孢子，因为内生孢子可能污染与最终产品接触的物质，例如包装在食品或液体包装纸板中的食品。例如，对于用于比萨盒、咖啡杯等的食品包装纸板，最大内生孢子含量通常<1000CFU/g干纸板，并且存在最大允许内生孢子含量<250CFU/g干纸板的最终用途。传统上，通过使用常规培养方法来检测细菌内生孢子，这是耗时的。通常，培养方法仅在取样48-72小时后才能提供结果。应当理解，在纸或纸板的连续生产中，该延迟不是最佳的。例如，及时调整孢子控制杀生物剂程序朝向变化的工艺条件是不可能，因为后续培养结果仅在上述指出的延迟之后才能获得。这使得杀生物剂的进料不必要地复杂并且难以优化。因此，极需快速监测造纸厂或制板厂的含水工艺中的细菌内生孢子。本专利技术的一个目的是最小化或甚至可以消除现有技术中存在的缺点。本专利技术的另一个目的是提供一种用于定量监测造纸厂或制板厂的含水环境中的细菌内生孢子的快速和有成本有效的方法。通过具有以下给出的在独立权利要求书的特征部分中的特征的本专利技术来实现这些目的。本专利技术的一些优选实施方案在从属权利要求中给出。根据本专利技术的用于定量监测造纸厂或制板厂的含水环境中的细菌内生孢子的通常方法包括至少以下步骤：-获得来自含水环境的至少第一含水样品，-通过适当处理，优选通过将第一样品加热至所期望的高温来破坏第一样品中的细菌繁殖体，-向经处理的第一样品加入插入剂，并允许其与被破坏的细菌进行相互作用，和-通过使用定量聚合酶链反应(qPCR)来测定第一样品中的内生孢子水平。现在已经令人惊奇地发现，通过使用包括破坏细菌繁殖体，与插入剂的相互作用和实时定量聚合酶链反应(qPCR)的步骤的方法，能够获得对于源自造纸或制板的样品中细菌内生孢子水平的快速测定。监测方法为造纸厂或制板厂的含水环境中的内生孢子水平提供了可靠的测定结果。因此，根据本专利技术的方法提供了快速检测由诸如pH或氧化还原波动等工艺条件的意外变化引起的内生孢子爆发的可能性。以这种方式可将质量差的例如包装级纸或纸板产品的生产最小化。此外，能够避免向工艺进料错误的杀生物剂，即避免非杀死剂量的杀生物剂的进料(其可引发由于例如氧化应激的内生孢子形成)。在本专利技术的上下文中，术语“内生孢子”被理解为由细菌形成的休眠和非生殖结构体。内生孢子包含细菌的DNA及其一部分由保护性外覆盖物包裹的细胞质。在有利条件下，内生孢子可萌发至代谢活性状态，即繁殖态。根据本专利技术，从造纸厂或制板厂的含水环境中获得或采集至少第一含水样品。样品量通常在10-100ml，优选20-30ml的范围内，且通常样品的可用性不是限制因素。作为实例，可以给出在某些纸和纸板的制造过程中，在期望通过使用高的杀生物剂剂量将总的内生孢子含量保持在非常低的水平，例如<1000CFU/ml的情况下，可使用100ml的样品量。另一方面，在其中细菌细胞含量可能处于高水平，即约108CFU/ml的水平的工艺水中，可认为25ml的样品量更实用。样品可包含纤维素纤维和/或原纤维，并且具有高达2至8重量％的固体含量。样品通常还包含用于纸或纸板制造的各种化学品和/或化合物，例如淀粉；无机填料颗粒；合成聚合物，例如聚丙烯酰胺。在本专利技术的方法开始时，通过使用合适的处理来破坏细菌繁殖体。合适的处理可以是物理处理，其中样品经受例如辐射，例如UV或加热，或化学处理，其中样品经受合适剂量水平的杀生物剂，该剂量水平破坏细菌繁殖体，但在随后的方法步骤期间不干扰插入剂的性能。根据一个优选实施方案，将第一样品加热至至少60℃，优选至少70℃，更优选至少75℃的所期望的高温。使用的最高温度通常为100℃，优选80℃。将样品保持在高温下至少10分钟，优选至少15分钟，更优选至少20分钟。换言之，破坏细菌繁殖体的一种优选方法是将样品加热到75-80℃的温度，并将样品保持在该高温下15-60分钟，优选20-40分钟。各种在标准大气压下和在升高压力下的热处理方法都是本领域已知的。在优选的实施方案中，热处理步骤在现场和/或工业条件下是容易、快速和实用的，其中它可通过使用常压下的水浴来进行。将第一样品加热至上述定义的高温导致样品的巴氏杀菌并破坏存在于样品中的细菌繁殖体细胞。加热后，样品包含破裂的，即被杀死和破坏的细菌繁殖体细胞，和通常未受影响的细菌内生孢子。在破坏步骤之前，优选通过加热，可任选但优选将第一样品过滤以从样品的液相中分离出不需要的固体颗粒物质，例如固体颗粒、纤维、原纤维等。这种用于分离不需要的固体颗粒物质的初步过滤通常是快速的并且例如通过布氏漏斗，通过使用具有约3mm开口的过滤器进行。根据本专利技术的一个实施方案，在破坏步骤之后过滤第一样品，以从样品的液相中分离经破坏的细菌繁殖体细胞以及内生孢子。可通过使用具有例如0.4μm开口的过滤器进行过滤。收集细菌细胞和内生孢子和/或附着在过滤器上，这简化了经处理的第一样品的进一步处理。优选在上述过滤步骤之后，向经处理的第一样品加入插入剂，并使试剂与被破坏的细菌细胞进行相互作用。根据本专利技术的一个实施方案，插入剂选自叠氮溴化丙锭(PMA)、叠氮溴化乙锭(EMA)、溴化乙锭、小檗碱、普罗黄素、柔红霉素、阿霉素和沙利度胺。优选的插入剂是叠氮溴化丙锭(PMA)。优选以使得来自经破坏的细菌细胞的所有DNA都与插入剂发生相互作用的量将插入剂加入到经处理的第一样品中。因此，能够保证在后续的qPCR步骤中没有来自细菌繁殖体细胞的DNA被倍增，并且它们在qPCR步骤中不产生信号。然而，优选避免不必要的夸张过量的插入剂的添加，因为它可能产生插入剂扩散至内生孢子中并开始与内生孢子DNA相互作用的风险。通常以提供<100μM，优选10-90μM，更优选25-75μM，甚至更优选40-60μM的插入剂浓度的量将插入剂加入到样品中。在加入插入剂后，允许第一样品避光孵育。孵育时间为1-30分钟，优选2-10分钟，更优选4-6分钟。当在室温下暴露于优选具有约400-500nm的波长的强烈蓝光时，插入剂能够共价交联来自经破坏的细菌细胞的DNA双链。可例如通过使用发光二极管LED来产生蓝光。暴露时间可为1-30分钟，优选2-10分钟，更优选4-6分钟。在添加插入剂之前，样品优选不进行干燥。这意味着该方法优选不含将样品干燥的步骤。优选地，破坏步骤和插入剂的添加之间的时间延迟在实际操作中是尽可能短。在允许第一样品与插入剂相互作用后，通过使用定量聚合酶链反应qPCR测定第一样品中的内生孢子水平。通过使用qPCR来提取和倍增来自内生孢子的DNA。以下文献描述了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于定量监测造纸厂或制板厂的含水环境中的细菌内生孢子的方法，所述方法包括至少以下步骤：‑获得来自工业含水环境的至少第一含水样品，‑通过适当处理，优选通过将所述第一样品加热至所期望温度来破坏所述第一样品中的细菌繁殖体，‑向经处理的第一样品加入插入剂，并允许其与被破坏的细菌进行相互作用，和‑通过使用定量聚合酶链反应(qPCR)来测定所述第一样品中的内生孢子水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.27 FI 201551381.一种用于定量监测造纸厂或制板厂的含水环境中的细菌内生孢子的方法，所述方法包括至少以下步骤：-获得来自工业含水环境的至少第一含水样品，-通过适当处理，优选通过将所述第一样品加热至所期望温度来破坏所述第一样品中的细菌繁殖体，-向经处理的第一样品加入插入剂，并允许其与被破坏的细菌进行相互作用，和-通过使用定量聚合酶链反应(qPCR)来测定所述第一样品中的内生孢子水平。2.如权利要求1所述的方法，特征在于将至少一种杀生物剂供给至所述含水环境中，并且基于所测定的内生孢子水平来测定进料的杀生物剂的量。3.如权利要求1或2所述的方法，特征在于通过将所述第一样品加热至至少60℃，优选至少70℃，更优选至少75℃的所期望温度来进行所述细菌繁殖体的破坏。4.如前述权利要求1-3中任一项所述的方法，特征在于在例如通过加热的破坏步骤之前，过滤所述第一样品以从所述样品中分离固体颗粒材料。5.如前述权利要求1-4中任一项所述的方法，特征在于-获得来自所述含水环境的至少第二含水样品，-测定所述第二样品中的细菌繁殖体细胞的量，和-将来自所述第一样品的经测定的内生孢子水平与所述第二样品中的经测定的细菌繁殖体细胞的量进行比较。6.如前述权利要求1-5中任一项所述的方法，特征在于所述插入剂选自叠...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·里希宁，M·劳拉埃乌斯，马尔科·科拉里，J·阿霍拉，
申请(专利权)人：凯米罗总公司，
类型：发明
国别省市：芬兰,FI