一种用于基因突变检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测基因突变的方法，该方法先后将被测样品进行ARMS‑PCR扩增和荧光探针PCR扩增，经过两轮扩增，被测样品的基因分型更精确，降低假阴性现象的发生率。本发明专利技术利用微流控技术将两轮扩增连起来，无需人工分配样品，避免不必要的样品污染。在扩增过程中无需检测，只需在扩增完全结束后检测扩增产物的基因型，省时省力，以便快速得出具有参考意义的临床结果。

A method for gene mutation detection

The invention discloses a method for detecting gene mutations, the method will be successively measured by ARMS fluorescence probe PCR amplification and PCR amplification, after two rounds of amplification, the sample genotyping more accurately and reduce the incidence of false negative phenomenon. The invention uses the microfluidic technology to connect two rounds of amplification, and does not need to manually assign samples, so as to avoid unnecessary sample pollution. In the amplification process, no need to detect, only after amplification complete detection of amplification products genotype, save time and effort, in order to quickly obtain reference clinical results.

【技术实现步骤摘要】
一种用于基因突变检测的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种用于检测基因突变的方法，具体涉及一种先后同时使用ARMS-PCR和荧光探针PCR，并整合微流控技术进行快速基因分型检测，并结合临床研究大数据，直接基于基因分型结果给出临床诊断的指导意见、临床用药的指导意见或者个性化治疗方案的建议等。
技术介绍
突变扩增系统(ARMS)又称等位基因特异性扩增法，是一种在聚合酶链式反应(PCR)基础上发展起来用于检测DNA中各种点突变的方法。突变扩增系统聚合酶链式反应技术(ARMS-PCR)的基本原理是，引物3′端的特异碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相对碱基，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，形成错配，链延伸反应就会因3′,5′-磷酸二酯键形成障碍而受阻。因此根据已知点突变设计2个引物，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。其扩增结果为:“野生”模板阻碍，“突变”基因放大；或“突变”模板阻碍，“野生”基因放大。ARMS-PCR技术对基因突变的检测来说具有极高的灵敏度，最低检测限可以达到1％以下，非常适合于进行各种目标靶点的基因分型。现有技术的ARMS-PCR操作是首先通过普通PCR仪进行PCR反应，然后琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，这种方法很容易由于开盖操作造成PCR产物的实验室污染并且影响不同样本的检测结果。同时，为了满足后续电泳检测的需要，普通ARMS-PCR的反应过程一般要30个循环以上，这样才能使产物的浓度较大，便于电泳的上样检测。但是反应循环数的增多以及电泳检测的操作都使检测的时间大大的延长，不适合于直接应用于临床基因检测。Taqman探针法是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次PCR循环后产物总量的方法。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，只与模板特异性结合，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。现有的Taqman探针法只用于实时荧光定量PCR过程中，每进行一个循环的PCR扩增，仪器就会检测一次荧光信号。在PCR过程完成后，仪器对收集到的所有信号进行分析，之后实验操作者做出判断。这在进行基础科研的过程中大多数情况下是必须的，但是在对临床样本进行定性检测的过程中是没有必要的。因为，在临床定性检测的时候，我们的PCR结果往往只需“有”或“无”两种结果，而对一般的荧光PCR过程来说，进行20—25个循环的反应时，阳性结果的荧光信号已经完全可以检测到了。25个循环之后是后段的对数期和平台期，这些循环所得到的PCR信号数据对于定性判断来说是没有任何意义的。这就造成了实验时间的浪费和仪器配置的浪费。在现有突变基因的检测中，由于ARMA-PCR法和Taqman探针法在DNA扩增反应中所用的引物不同，所以两种方法不能在同一个反应室中进行，而是各自被单独使用，以免影响检测结果。然而对于多突变基因检测，由于样本中突变拷贝的数目往往偏低，所以单独使用一种测序方法去检测其特异性，很可能会造成假阴性的现象，不能满足临床需求。专利公布号为CN104805181A的《一组基于ARMS-PCR法检测CYP3A4、CYP3A5基因多态性的引物及制备的试剂盒》专利中只采用了ARMS-PCR法为医生确定最佳药物剂量和个体化用药提供参考依据，特异性检测不能完全满足临床需求。临床基因突变的检测只需要“有”或“无”两种定性的结果，而现有技术中的ARMA-PCR和Taqman探针法是用于定量检测，每进行一个循环的PCR扩增，仪器就会检测一次荧光信号，在PCR过程完成后，仪器对收集到的所有信号进行分析，这样既耗时又耗力。目前这两种方法都是首先在PCR仪上进行PCR反应，之后再转移到毛细管电泳仪上来进行片段分析或者使用琼脂糖凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。这种操作很可能会在PCR产物的开盖转移过程中造成实验室污染，导致试验结果不准确；并且检测时间长，工作量大。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是：针对基因的已知点突变，提供一种高特异性和高灵敏度的检测方法，减少假阴性现象的发生，提高检测结果的正确率。本专利技术的另一个目的是：简化基因突变检测的方法，降低时间、仪器和人力成本，以便快速得出具有参考意义的临床结果。本专利技术的第三个目的是，减少试验过程中的污染，避免不必要的重复试验，而且使检测结果更准确。为了实现上述目的，本专利技术提出了一种用于突变基因的检测方法。包括以下步骤：1)设计引物和探针，引物为ARMS引物和Taqman引物，探针为Taqman探针；2)加入被测样品，在进行检测的时候，将被测样品加入样品池中；3)ARMS-PCR扩增，ARMS-PCR扩增在ARMS-PCR反应室中进行，提前加入ARMS引物及相应的PCR反应MIX，利用微流控技术将被测样品分配到ARMS-PCR反应室中进行扩增；4)荧光探针PCR扩增，荧光探针PCR扩增在荧光探针PCR反应室中进行，提前加入Taqman引物和Taqman探针以及相应的PCR反应MIX，利用微流控技术将ARMS-PCR扩增后的产物分配到荧光探针PCR反应室中进行扩增；5)根据阳性反应确定基因型。对于突变基因，尤其是多突变基因，往往在同一个位点具有很多种基因突变，并且由于样本中突变拷贝的数目往往偏低，所以使用测序的方法很可能会造成假阴性的现象。我们使用本专利技术的ARMS-PCR扩增和荧光探针RCR扩增能很好的解决这些问题。被测样品先进行ARMS-PCR扩增，富集突变基因还使突变基因被初步分型，再进行荧光探针PCR扩增，一些相近基因型在荧光探针PCR扩增时，可以被再次进行分别扩增。两轮扩增反应分别在ARMS-PCR反应室和荧光探针PCR反应室中进行，各自所用的引物也不相同，荧光探针PCR反应室中还预制有Taqman探针。利用Taqman探针上的荧光染料检测基因型。该检测方法快速准确。针对一个基因突变位点，ARMS引物有野生型ARMS引物和至少一种突变型ARMS引物；针对一个基因突变位点，Taqman引物有野生型Taqman引物和至少一种突变型Taqman引物；针对一个基因突变位点，Taqman探针有野生型Taqman探针和至少一种突变型Taqman探针。在对一种基因突变进行检测时，根据基因型的数目，设计相应数目的ARMS引物、Taqman引物以及Taqman探针。本专利技术采用微流控技术将被测样品分配到相应的反应室中，微泵或离心是微流控技术的压力驱动力。本专利技术的整个过程只在两轮扩增完全结束后进行了一次确定基因型的检测，避免不必要的重复检测，节省时间。具体操作为：用激光发射器发出激发荧光染料所需波长的激光，荧光检测器检测荧光染料的发射光，并将其转换为电信号计算荧光强度，比较荧光强度与设定的阈值，从而确定基因型。本专利技术的方法用于检测基因点突变。本专利技术的有益效果是：本专利技术先后将被测样品进行ARMS-PCR扩增和荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测基因突变的方法，其特征在于，步骤包括1)设计引物和探针，所述的引物为ARMS引物和Taqman引物，所述的探针为Taqman探针；2)加入被测样品，在进行检测的时候，将所述的被测样品加入样品池中；3)ARMS‑PCR扩增，所述的ARMS‑PCR扩增在ARMS‑PCR反应室中进行，提前加入ARMS引物及相应的PCR反应MIX，利用微流控技术将2)中的被测样品分配到所述的ARMS‑PCR反应室中进行扩增；4)荧光探针PCR扩增，所述的荧光探针PCR扩增在荧光探针PCR反应室中进行，提前加入Taqman引物、Taqman探针及相应的PCR反应MIX，利用微流控技术将3)中扩增后的产物分配到所述的荧光探针PCR反应室中进行扩增；5)根据阳性反应确定基因型。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测基因突变的方法，其特征在于，步骤包括1)设计引物和探针，所述的引物为ARMS引物和Taqman引物，所述的探针为Taqman探针；2)加入被测样品，在进行检测的时候，将所述的被测样品加入样品池中；3)ARMS-PCR扩增，所述的ARMS-PCR扩增在ARMS-PCR反应室中进行，提前加入ARMS引物及相应的PCR反应MIX，利用微流控技术将2)中的被测样品分配到所述的ARMS-PCR反应室中进行扩增；4)荧光探针PCR扩增，所述的荧光探针PCR扩增在荧光探针PCR反应室中进行，提前加入Taqman引物、Taqman探针及相应的PCR反应MIX，利用微流控技术将3)中扩增后的产物分配到所述的荧光探针PCR反应室中进行扩增；5)根据阳性反应确定基因型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，针对一个位点的基因突变，所述的ARMS引物，有野生型ARMS引物和至少一种突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏宏泉，孙相鑫，
申请(专利权)人：魏宏泉，孙相鑫，
类型：发明
国别省市：新疆,65