一种鉴定水稻垩白性状的分子标记、鉴定方法及应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，公开了一种鉴定水稻垩白性状的分子标记、鉴定方法及应用，所述分子标记为Chalk5‑TPAP，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Chalk5‑TPAP‑O‑F、SEQ ID NO.2所示的Chalk5‑TPAP‑O‑R、SEQ ID NO.3所示的Chalk5‑TPAP‑I‑F和SEQ ID NO.4所示的Chalk5‑TPAP‑I‑R。该分子标记可以对Chalk5基因的水稻垩白性状的两种等位基因型进行直接鉴定，且准确率达100％，能够较好区分两种等位基因型，不受环境条件的影响，鉴定操作方法，耗费较低，适合于大范围推广使用。

A molecular marker, identification method and application for identification of chalkiness traits in Rice

The invention belongs to the technical field of molecular biology, molecular marker identification, discloses a method for identifying Rice Chalkiness Characters and application of the molecular marker for Chalk5 TPAP, including the nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 shown Chalk5 TPAP O F, SEQ ID NO.2 shown in Chalk5 TPAP O R, SEQ ID NO.3 shown Chalk5 TPAP I F and SEQ ID shown in the NO.4 Chalk5 TPAP I R. The molecular marker can direct identification of Chalk5 gene of rice chalkiness two allele, and the accuracy rate is 100%, to distinguish the two allele, is not affected by environmental conditions, the identification method of operation, low cost, suitable for large-scale popularization and application.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定水稻垩白性状的分子标记、鉴定方法及应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种鉴定水稻垩白性状的分子标记、鉴定方法及应用。
技术介绍
垩白为稻米胚乳中不透明的部分，是胚乳中淀粉及蛋白质排列不紧密形成的光学特性，垩白性状对稻米外观品质、加工品质均有负向影响。低垩白水稻品种其商业价值较高，受到育种工作者的青睐。但是目前，垩白性状主要通过表型进行鉴定，在育种早世代难以开展相关的选择工作，且表型鉴定受环境条件影响较大，年度间鉴定结果不近一致，且需要耗费大量人力及物力，在育种工作早世代时难以开展选择工作，通过分子标记辅助进行低垩白稻米品种的选择可以大大提高选择效率，不受世代及样品数量的限制，是改良水稻垩白性状的最佳手段。Chalk5基因作为调控籼稻腹白率的主效QTL于2014年被成功克隆；研究学者亦通过全基因组关联分析证实了Chalk5基因在籼稻中的作用。Chalk5基因被定位于水稻5号染色体，高垩白Chalk5等位基因型与低垩白chalk5等位基因型存在2个功能性SNP差异，分别为启动子ATG前-721位C-T及-485位A-T，两个SNP分离方向一致。然而，现有技术针对于Chalk5基因，目前可供鉴定上述两种等位基因型的功能性分子标记缺失，致使基于Chalk5基因鉴定水稻垩白性状的分子手段难以推广使用。
技术实现思路
本专利技术提供的一种鉴定水稻垩白性状的分子标记、鉴定方法及应用，是目前唯一一个针对于Chalk5基因构建的PCR类型的功能性分子标记，该分子标记能够较好区分水稻垩白性状的两种等位基因型，操作简单，耗费较低。本专利技术的第一个目的是提供一种鉴定水稻垩白性状的分子标记，所述分子标记为Chalk5-TPAP，包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的Chalk5-TPAP-O-F、SEQIDNO.2所示的Chalk5-TPAP-O-R、SEQIDNO.3所示的Chalk5-TPAP-I-F和SEQIDNO.4所示的Chalk5-TPAP-I-R。本专利技术的第二个目的是提供一种利用上述分子标记鉴定水稻垩白性状的方法，包括以下步骤：S1，提取待测水稻材料的基因组DNA；S2，以S1获得的基因组DNA为模板，以Chalk5-TPAP-O-F、Chalk5-TPAP-O-R、Chalk5-TPAP-I-F和Chalk5-TPAP-I-R为引物进行PCR扩增；S3，结果判定以Chalk5-TPAP-O-F与Chalk5-TPAP-O-R结合扩增出364bp片段作为阳性对照；当Chalk5-TPAP-I-F与Chalk5-TPAP-O-R结合扩增出225bp片段时，检测材料为低垩白等位基因型T；当Chalk5-TPAP-O-F与Chalk5-TPAP-I-R结合扩增出194bp片段时，检测材料为高垩白等位基因型C。优选的，上述分子标记鉴定水稻垩白性状的方法，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30、58.4℃退火30s、72℃延伸30s-50s、35次循环；72℃延伸10min；4℃冷却10min。本专利技术的第三个目的是提供一种上述分子标记在水稻垩白性状分子标记辅助选育中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种上述鉴定水稻垩白性状的方法在水稻垩白性状分子标记辅助选育中的应用。与现有技术相比，本专利技术提供一种鉴定水稻垩白性状的分子标记、鉴定方法及应用，具有以下有益效果：本专利技术基于Chalk5基因启动子ATG前-721位C-T的功能性SNP差异，利用四引物受阻扩增突变原理(Tetra-primerARMS-PCR)，设计基于PCR的功能性分子标记Chalk5-TPAP，并构建了该分子标记的PCR扩增体系。分子标记Chalk5-TPAP是目前唯一一个针对于Chalk5基因构建的PCR类型的功能性分子标记。分子标记Chalk5-TPAP是从DNA碱基的功能性多态性进行鉴定，专利技术人经过大量试验材料证实该分子标记可以对Chalk5基因的水稻垩白性状的两种等位基因型进行直接鉴定，且准确率达100％，能够较好区分两种等位基因型，不受环境条件的影响，鉴定操作方法简单，耗费较低，而其他现有文献公开的引物分子标记只能达到50-70％的鉴定准确率；本专利技术的分子标记Chalk5-TPAP为Chalk5基因等位基因型的鉴定及相应的分子标记辅助选择工作打下了坚实的基础，适合于大范围推广使用。附图说明图1为H94材料的Chalk5基因；图2为珍汕97材料的Chalk5基因；图3为不同退火温度组进行PCR扩增结果；其中，M泳道为DNA标准分子量；1、3、5、7、9、11、13、15泳道分别为珍汕97材料在55.1℃、55.4℃、55.8℃、56.3℃、57.1℃、57.7℃、58.4℃、59.1℃退火温度下的扩增结果；2、3、4、5、10、12、14、16泳道分别为H94材料在55.1℃、55.4℃、55.8℃、56.3℃、57.1℃、57.7℃、58.4℃、59.1℃退火温度下的扩增结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本专利技术提供的一种鉴定水稻垩白性状的分子标记，所述分子标记为Chalk5-TPAP，包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的Chalk5-TPAP-O-F、SEQIDNO.2所示的Chalk5-TPAP-O-R、SEQIDNO.3所示的Chalk5-TPAP-I-F和SEQIDNO.4所示的Chalk5-TPAP-I-R。具体按照以下方法获得：NCBI查找克隆序列：高垩白等位基因型珍汕97，KJ363317；低垩白等位基因型H94，KJ363318。选用启动子ATG前-721位C-T的SNP进行设计。利用在线引物设计软件Primer1进行分子标记设计，命名为Chalk5-TPAP，Chalk5-TPAP包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的Chalk5-TPAP-O-F、SEQIDNO.2所示的Chalk5-TPAP-O-R、SEQIDNO.3所示的Chalk5-TPAP-I-F和SEQIDNO.4所示的Chalk5-TPAP-I-R，其序列信息详见表1。SEQIDNO.5为低垩白等位基因型H94的核苷酸序列，其中第1-28位为Chalk5-TPAP-O-F的结合位点，第337-364位为Chalk5-TPAP-O-R的结合位点，第140-165位为Chalk5-TPAP-I-F的无效扩增位点，第165-197位为Chalk5-TPAP-I-R的结合位点。如图1所示，图1中SNP差异位点用加黑斜体字母T表示，带下划线的字母表示引物结合位点，实线箭头表示引物扩增方向，虚线箭头表示不能有效扩增。SEQIDNO.6为高垩白等位基因型珍汕97的核苷酸序列，其中第1-28位为Chalk5-TPAP-O-F的结合位点，第337-364位为Chalk5-TPAP-O-R的结合位点，第140-165位为Chalk5-TPAP-I-F的结合位点，第165-197位为Chalk5-TPAP-I-R的无效扩增位点。如图2所示，图2中SNP差异位点用加黑斜体字母本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定水稻垩白性状的分子标记，其特征在于，所述分子标记为Chalk5‑TPAP，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Chalk5‑TPAP‑O‑F、SEQ ID NO.2所示的Chalk5‑TPAP‑O‑R、SEQ ID NO.3所示的Chalk5‑TPAP‑I‑F和SEQ ID NO.4所示的Chalk5‑TPAP‑I‑R。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定水稻垩白性状的分子标记，其特征在于，所述分子标记为Chalk5-TPAP，包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的Chalk5-TPAP-O-F、SEQIDNO.2所示的Chalk5-TPAP-O-R、SEQIDNO.3所示的Chalk5-TPAP-I-F和SEQIDNO.4所示的Chalk5-TPAP-I-R。2.一种利用权利要求1所述的分子标记鉴定水稻垩白性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，提取待测水稻材料的基因组DNA；S2，以S1获得的基因组DNA为模板，以Chalk5-TPAP-O-F、Chalk5-TPAP-O-R、Chalk5-TPAP-I-F和Chalk5-TPAP-I-R为引物进行PCR扩增；S3，结果判定以Chalk5-TPAP-O-F与Chal...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛艇，张战，李旭，倪善军，赵一洲，李鑫，张丽丽，刘妍，黄河，于小彭，荆华，李振宇，刘福才，
申请(专利权)人：辽宁省盐碱地利用研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21