西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子标记和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子标记和应用。结合肉色为粉红色和红色的母本和父本杂交的F2群体遗传连锁图谱和对父母本、F1和F2群体进行肉色的表型鉴定，用Rqtl‑IM‑binary法进行QTL初定位；结合亲本的重测序设计InDel引物；用InDel引物在父母本、F1进行多态性筛选，用多态性的InDel引物在F2群体中进行基因型鉴定；用JoinMap4.0进行图谱构建。经上述技术措施，得到西瓜肉色性状主效基因位点

Major gene loci and InDel molecular markers and their application in watermelon flesh color traits

The present invention discloses a major gene locus of watermelon flesh color trait and its InDel molecular marker and its application. Pink and red female and male parent of hybrid F2 population genetic linkage map and to the parents, F1 and F2 groups were colored with Rqtl phenotype with color, IM binary method QTL initial positioning; re sequencing InDel primers were designed according to the parents; InDel primers in the F1 polymorphism, parents screening InDel primers polymorphism was genotyped in the F2 group; mapping with JoinMap4.0. The main gene loci of watermelon flesh color traits were obtained by the above technical measures

【技术实现步骤摘要】
西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子标记和应用
本专利技术属于分子生物学及遗传育种
，具体涉及一种西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子标记和应用。
技术介绍
西瓜肉色是西瓜遗传育种的一个重要性状，肉色的变异非常丰富。根据2012年国际葫芦科遗传协会年报中发表的“西瓜基因目录2012”所述，利用传统的遗传学实验目前已知控制西瓜肉色的基因有8个：B、C、i-C、Wf、Yscr、Ycrl、yo、y。传统的遗传学采用数理统计的方法，只能将控制肉色的一个或多个基因作为一个整体进行研究，不能确定单个基因在染色体上的位置和基因产生的效应。随着分子标记和测序技术的发展，西瓜肉色基因的研究有了一定的进展，国内有学者利用白肉西瓜PI296341-FR和红肉西瓜97103分别在2号和4号连锁群定位到了肉色基因，并克隆了控制红肉的B基因(LCYB)，同时将上位性Wf基因位置缩减到了2号染色体的较小区域。最新研究利用西瓜转录组筛选的方法发现基因CIPHT4；2的高表达是西瓜肉色形成所必需的。但西瓜其他肉色基因的遗传研究相对很少或是没有，现有标记的基因型和表型的符合率比较低，利用标记进行辅助选择西瓜肉色育种的选择效率和准确率都比较低。
技术实现思路
本专利技术提供一种西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子标记，并在西瓜肉色育种中进行了应用，可为鉴定西瓜肉色提供新手段，加速西瓜肉色的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。为实现上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：设计一种西瓜肉色性状主效基因位点FC6，位于西瓜6号染色体18-23.8Mb处。设计一种西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记，其核苷酸序列为AAATGAAACATGATATATTAAGG。西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记的上游引物为InDel19_fc6F，核苷酸序列为CTTTAATGCCTAATAACCAA；分子标记的下游引物为InDel19_fc6R，核苷酸序列为AAAGGAGGAAATTCAAATCA。设计一种西瓜肉色基因型的鉴定方法，包括以下步骤：①DNA提取：利用CTAB法提取西瓜植株总DNA；②PCR扩增：反应体系：100ng/μL西瓜植株总DNA1μL、InDel19_fc6F(10μmol/L)1μL、InDel19_fc6R(10μmol/L)1μL、2×PowerTaqPCRMasterMix12.5μL、ddH2O9.5μL；反应程序：94℃5min，35个循环的94℃20s、55℃1min、72℃30s、72℃5min；③电泳图谱分析：对所述扩增产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读，找到目标条带，根据所述扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型，198bp的条带代表粉红肉色基因型，175bp的条带代表红肉色基因型。西瓜肉色性状主效基因位点或西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记在西瓜肉色基因图位克隆中的应用。本专利技术的有益技术效果在于：1.本专利技术首次在6号染色体定位了西瓜肉色的主效基因位点，可解释90.36％的表型方差。2.本专利技术肉色紧密连锁的InDel分子标记变异稳定、检测容易，并且成本低廉，该标记的准确率达到96.7％。3.本专利技术为鉴定西瓜肉色提供了快速、便捷的新手段，提高了西瓜肉色育种的选择效率和准确率，从而能加快育种进程。附图说明图1是肉色形态学标记的连锁分析与QTL效应的对比图；图2是利用分子标记InDel19_fc6的引物在部分F2群体基因组DNA中的PCR结果电泳图。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本专利技术的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的原料如无特别说明，均为市售常规原料；所涉及的检测方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1：西瓜肉色性状主效基因位点的确定，具体步骤如下：(1)西瓜肉色全基因组QTL定位依据文献Shangetal.,Constructionofahigh-densitygeneticmapforwatermelon(CitrulluslanatusL.)basedonlarge-scaleSNPdiscoverybyspecificlengthamplifiedfragmentsequencing(SLAF-seq).ScientiaHorticulturae2016,203:38-46.中利用母本“ZXG01478”(粉红肉)和父本“14CB11”(红肉)杂交获得F2群体构建的高密度的遗传连锁图谱，对父母本、F1和F2群体的93个单瓜进行肉色的直观鉴定；结合遗传连锁图谱和F2群体表型鉴定结果，利用Rqtl-IM-binary方法进行QTL初定位，仅在LG6鉴定到一个肉色的主效QTL(FC6)，如图1所示，其LOD峰值为23.65，解释90.36％的表型变异，对应的置信区间(2-LOD)为69-106cM，对应的物理位置为6号染色体的18-23.8Mb。(2)父母本的重测序利用母本和父本进行了22×深度的高通量重测序。两个亲本共检测到45134个小的InDel。(3)QTL区域InDel标记的开发在QTL定位的峰值区域搜索插入缺失片段大于20bp的InDels。利用Perl自编程序提取插入缺失相应位置前后各500bp的序列，设计InDel引物。实施例2：西瓜F2群体分子标记分析，具体步骤如下：(1)利用CTAB法提取西瓜叶片总DNA，具体步骤如下：①取1g新鲜西瓜叶片放入研钵，加入液氮研成粉末状，随即转入加有1mLCTAB抽取液的离心管中，使二者充分混匀，然后置于65℃恒温水浴60min，其间颠倒混合2-3次；②从水浴锅取出后，8000rpm离心1min；③取上清液置于另一离心管中，加与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合液，轻轻颠倒使其充分混匀，其中氯仿和异戊醇体积比为24：1；④10000rpm离心5min，取上清液；⑤加入0.7倍体积的提前预冷30min的异丙醇，混匀后置于-20℃冷冻不超过30min让DNA析出；取出后10000rpm离心5min，留沉淀弃上清液；⑥用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，打开离心管盖子晾干；⑦加入200μL的蒸馏水溶解DNA；用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20℃冰箱中保存备用。(2)PCR反应体系和程序PCR反应体系如下：西瓜叶片总DNA(100ng/μl)1μL、Forwardprimer(10μmol/L)1μL、Reverseprimer(10μmol/L)1μL、2×PowerTaqPCRMasterMix12.5μL、ddH2O9.5μL。PCR反应程序为：94℃5min，35个循环的94℃20s、55℃1min、72℃30s、72℃5min。(3)对PCR产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。①试剂配制：A.5×TBE：Tris-base53.9g；EDTA3.72g；硼酸27.5g；用蒸馏水定容至1L。B.40％聚丙烯酰胺溶液：聚丙烯酰胺193.34g；甲叉双丙烯酰胺6.66g；用蒸馏水定容至500mL。C.8％聚丙烯酰胺凝胶：40％聚丙烯酰胺溶液10Ml；5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种西瓜肉色性状主效基因位点，其特征在于，所述位点为

【技术特征摘要】
1.一种西瓜肉色性状主效基因位点，其特征在于，所述位点为FC6，位于西瓜6号染色体18-23.8Mb处。2.一种西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列为AAATGAAACATGATATATTAAGG。3.根据权利要求2所述西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记，其特征在于，所述分子标记的上游引物为InDel19_fc6F，核苷酸序列为CTTTAATGCCTAATAACCAA；所述分子标记的下游引物为InDel19_fc6R，核苷酸序列为AAAGGAGGAAATTCAAATCA。4.一种西瓜肉色基因型的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）DNA提取：利用CTAB法提取西瓜植株总DNA；（2）PCR扩增：反应体系：1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娜，马双武，尚建立，王吉明，李楠楠，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41