猪pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种猪CRTC3的pCRTC3‑sgRNA表达载体的构建方法，包括以下步骤：1)、根据载体的内切酶位点信息和pCRTC3序列得到4个靶序列，根据所述靶序列设计并合成4对sgRNA引物；2)、pCRTC3‑sgRNA表达载体的构建：BbsI酶切的pX330‑Cas9载体与pCRTC3的sgRNA引物退火后产物连接转化，得到pCRTC3‑sgRNA表达载体的重组质粒。本发明专利技术还同时公开了上述pCRTC3‑sgRNA表达载体的用途：用于敲除猪细胞中pCRTC3基因的表达；用于研究pCRTC3基因对猪肠道上皮细胞IPEC‑J2细胞紧密连接蛋白和糖脂代谢关键基因表达产生的影响。

Vector construction method and application of pCRTC3 expression of porcine sgRNA

The invention discloses a pig CRTC3 pCRTC3 sgRNA expression vector construction method, which comprises the following steps: 1), 4 target sequences and pCRTC3 sequences according to the restriction sites of information carrier, according to the target sequence was designed and synthesized 4 pairs of sgRNA primers; 2), pCRTC3 sgRNA expression vector: sgRNA primer annealing BbsI digested pX330 Cas9 carrier and pCRTC3 connected products after transformation, pCRTC3 sgRNA expression plasmid vector. The invention also discloses the pCRTC3 sgRNA expression vector uses: knockdown the expression pCRTC3 gene in pig cells; used to study the pCRTC3 gene of porcine intestinal epithelial cells IPEC J2 cell tight junction protein and lipid metabolism key gene expression influence.

【技术实现步骤摘要】
猪pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法及用途
本专利技术涉及一种猪CRTC3(pCRTC3)基因的pX330-Cas9-pCRTC3-sgRNA(pCRTC3-sgRNA)表达载体的构建方法及用途，属于生物和现代农业
的应用技术。
技术介绍
糖脂代谢是最主要的生命活动之一，直接影响着动物的脂肪沉积。在畜牧生产中，糖脂代谢直接影响着畜产品的产量和品质；同时，糖脂代谢也与人类健康息息相关。因此，探讨动物糖脂代谢及其对脂肪沉积的影响及调控机制，对畜牧生产和人类健康都有非常重要的意义。研究证实，环磷酸腺苷(cAMP)信号通路直接调控能量平衡和养分分配。cAMP信号通路主要是通过cAMP应答元件结合蛋白(CREB)及其调节转录辅激活因子(CRTCs)发挥转录调节功能CRTC3是CRTCs家族的一员，在糖脂代谢过程中发挥着重要的功能。CRTC3具有高度保守的N端CREB结合域，在细胞核上与CREB的bZIP结构域结合并提高CREB的活性。CRTC3的亚细胞定位主要受磷酸化调控，去磷酸化介导的CRTC3进核是上调CREB靶基因的一个关键步骤。研究发现，CRTC3去磷酸化促进肝细胞中糖原本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪CRTC3的pCRTC3‑sgRNA表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤：1)、根据载体的内切酶位点信息和pCRTC3序列得到4个靶序列，根据所述靶序列设计并合成4对sgRNA引物；2)、pCRTC3‑sgRNA表达载体的构建：BbsI酶切的pX330‑Cas9载体与pCRTC3的sgRNA引物退火后产物连接转化，得到pCRTC3‑sgRNA表达载体的重组质粒。

【技术特征摘要】
1.猪CRTC3的pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤：1)、根据载体的内切酶位点信息和pCRTC3序列得到4个靶序列，根据所述靶序列设计并合成4对sgRNA引物；2)、pCRTC3-sgRNA表达载体的构建：BbsI酶切的pX330-Cas9载体与pCRTC3的sgRNA引物退火后产物连接转化，得到pCRTC3-sgRNA表达载体的重组质粒。2.根据权利要求1所述的pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法，其特征是：所述步骤1)中的4对sgRNA引物为：引物Ⅰ：pCRTC3-sg1S:5′-CACCGGAGAATGATGTCCACGGGGA-3′pCRTC3-sg1AS:5′-AAACTCCCCGTGGACATCATTCTCC-3′，引物Ⅱ：pCRTC3-sg2S:5′-CACCGGGCCAGGAGAAAGTGTGAGG-3′pCRTC3-sg2AS:5′-AAACCCTCACACTTTCTCCTGGCCC-3′，引物Ⅲ：pCRTC3-sg3S:5′-CACCGGCTGAGGTCTTTGAACAGGC-3′pCRTC3-sg3AS:5′-AAACGCCTGTTCAAAGACCTCAGCC-3′，引物Ⅳ：pCRTC3-sg4S:5′-CACCGGTCCTTCCCCAGCCCGTTGA-3′pCRTC3-sg4AS:5′-AAACTCAACGGGCTGGGGAAGGACC-3′。3.根据权利要求2所述的pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法，其特征是：所述步骤2)为：将pX330...

【专利技术属性】
技术研发人员：单体中，刘嘉琪，徐子叶，汪以真，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33