一种微环DNA转染T细胞制备临床级CAR‑T细胞制剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种微环DNA转染T细胞制备临床级CAR‑T细胞制剂的方法，所述方法包括应用非病毒的微环DNA（minicircle DNA,mcDNA）载体高效率转染T细胞制备临床级CAR‑T细胞制剂的技术，所述mcDNA转染技术包括携带目的基因的嵌合抗原受体（CAR）的设计与合成、目的基因‑CAR亲本载体质粒的构建、目的基因‑CAR‑mcDNA载体质粒的提取、目的基因‑CAR‑mcDNA载体质粒转染T细胞、及应用mcDNA转染技术所制备的临床级CAR‑T细胞制剂，进一步公开了所述mcDNA转染技术的用途，发现本mcDNA转染技术具有对哺乳动物T细胞转染效率高、表达稳定、功能稳定、不影响细胞基因特性的特征；所制备CAR‑T细胞制剂具有靶向性强、杀伤效率高、临床安全等特征，所述mcDNA转染技术可用于治疗各种实体肿瘤及血液和淋巴系统肿瘤的临床级CAR‑T细胞制剂的制备。

A method of producing CAR clinical grade T cells DNA transfected T cell preparation of micro ring system

The invention discloses a method for preparing CAR clinical grade T cells DNA transfected T cell preparation of micro ring system, the method includes the application of non DNA micro ring virus (minicircle DNA, mcDNA) carrier efficient transfection of T cells for preparation of clinical grade CAR T cell preparation technology, the mcDNA transfection the technology includes a chimeric antigen receptor target gene carrying (CAR) design and synthesis, the target gene CAR parental vector plasmid construction, gene CAR mcDNA Plasmid Extraction, CAR gene mcDNA vector plasmid was transfected into T cells, and the application of mcDNA staining technique prepared by clinical stage CAR T cell preparation, further discloses the use of mcDNA transfection technique, the mcDNA technology has the characteristics of transfected mammalian T cells with high transfection efficiency and expression stability, stable function, does not affect the cell gene characteristics The preparation of CAR; T cell preparation has strong targeting killing, high efficiency, safe clinical features, the transfection of mcDNA technology can be used for clinical grade CAR T cell preparations for the treatment of various solid tumors and blood and lymphatic system tumor preparation.

【技术实现步骤摘要】
一种微环DNA转染T细胞制备临床级CAR-T细胞制剂的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及应用微环DNA转染技术，制备临床级CAR-T细胞制剂的方法。
技术介绍
肿瘤生物治疗已被公认为继手术、放疗、化疗三大传统治疗手段之后的第四大手段。生物治疗主要包括细胞免疫治疗和抗体靶向药物两大类。近年来细胞免疫治疗发展迅猛，在CTL/TIL获得良好临床疗效的基础上，免疫检测点阻断CTL/TIL、TCR-T、及CAR-T等新型细胞制剂大量进入临床试验，以CD-19/CD20靶向CAR-T治疗B细胞性淋巴瘤为代表的临床试验，获得了90%以上的杀伤效率而成为里程碑式突破。因而CAR-T细胞免疫治疗可能成为肿瘤的重要治疗手段。嵌合抗原受体（CAR）的典型结构包括由识别抗原的单链抗体的轻链和重链可变区连接成的scFv构成细胞外绑定区、能使单链抗体具有灵活性的铰链区、以及跨膜区和胞内信号肽区。胞外绑定区scFv不需要以MHC/抗原肽复合物的形式识别抗原，而是直接识别抗原，并且不管抗原的本质是蛋白类还是糖脂类。铰链区的大小，灵活度及伸展范围决定了scFv与肿瘤细胞表面抗原结合的能力。跨膜区在T细胞活化中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微环DNA转染T细胞制备临床级CAR‑T细胞制剂的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）目的基因‑CAR的设计与合成；（2）目的基因‑CAR亲本载体质粒的构建与保存；（3）目的基因‑CAR‑mcDNA载体质粒的提取；（4）目的基因‑CAR‑mcDNA转染T细胞制备CAR‑T细胞；（5）临床级、目的基因‑CAR‑T细胞制剂的制备及应用。

【技术特征摘要】
1.一种微环DNA转染T细胞制备临床级CAR-T细胞制剂的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）目的基因-CAR的设计与合成；（2）目的基因-CAR亲本载体质粒的构建与保存；（3）目的基因-CAR-mcDNA载体质粒的提取；（4）目的基因-CAR-mcDNA转染T细胞制备CAR-T细胞；（5）临床级、目的基因-CAR-T细胞制剂的制备及应用。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：目的基因-CAR的设计，其方法如下：①.使用DNAstar8.0软件分析筛选出抗目的基因的Fab序列及VH和VL序列，用于设计CAR中的scFv序列；②.设计信号肽序列IgGkappa，置于目的基因-scFv前端以引导CAR结构穿透靶细胞膜；③.按照Genebank（NCBI）中CD8、CD28、CD137及CD3ζ的基因序列设计目的基因-CAR的整体框架结构，并于该序列的前后端分别设置EcoR1和BamH1酶切位点；目的基因-CAR的合成，其方法如下：①.按上述结构进行目的基因-CAR的全基因序列合成；②.将合成后的目的基因-CAR全基因序列亚克隆到pUC57载体中制备成目的基因-CAR-pUC57质粒；目的基因-CAR亲本载体质粒的构建，其方法如下：①.应用质粒提取试剂盒分别对上述目的基因-CAR-pUC57质粒及微环DNA载体试剂盒（MC-EasyTMMinicircleDNAProductionkit；SBI）提供的微环DNA亲本载体质粒（pMC.CMV-MCS-EF1-GFP-SV40PolyA）进行质粒提取，获得质粒提取物；②.对步骤①所获目的基因-CAR-pUC57及pMC.CMV-MCS-EF1-GFP-SV40PolyA质粒提取物进行EcoR1及BamH1酶切反应获得酶切产物；③.将步骤②所获目的基因-CAR-pUC57及pMC.CMV-MCS-EF1-GFP-SV40PolyA酶切产物进行连接反应获得连接产物；④.将步骤③所获连接产物转化到微环DNA载体试剂盒所提供的特殊感受态菌液（ZYCY10P3S2TE.coli）中，30℃、250rpm摇菌培养90min，获得含有目的基因-CAR的亲本载体质粒菌液；⑤.将步骤④所获菌液50-200μl平铺在含50μg/ml卡那霉素的LB琼脂糖培养板上，37℃培养过夜，挑选克隆，小剂量提取质粒，酶切、电泳、测序鉴定；如基因序列正确，则将步骤④所获含目的基因-CAR的亲本载体质粒菌液-80℃甘油储存，以备后续目的基因-CAR-mcDNA载体质粒的提取；目的基因-CAR-mcDNA载体质粒的提取，其方法如下：①.将步骤（2）获取的目的基因-CAR亲本载体质粒菌液从-80℃移出，接种于含有50μg/ml卡那霉素的2ml的LB琼脂糖培养基上，30℃，250rpm，摇菌1-2h，测OD值以备培养条件调控；②.将目的基因-CAR亲本载体质粒菌液接种于含200ml生长培养基的无菌培养瓶中，30℃、250rpm摇菌过夜；③.取少量培养基检测PH值及OD值，调整PH值在6...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡守锋，蔡子琪，韩锦胜，杜萍萍，叶学帅，
申请(专利权)人：河北浓孚雨生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13