一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法，属于冠状病毒反向遗传技术领域。所述构建方法包括：以BAC载体为骨架，运用体外同源重组技术，快速完成包含禽传染性支气管炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建，将构建的重组质粒直接转染细胞，在细胞内转录获得具有感染性的转录本，并完成病毒包装，将细胞与培养基的混合液接种SPF鸡胚并传代，获得禽传染性支气管炎病毒反向遗传株。该构建方法操作简单，阳性克隆率高，而且获得的反向遗传株具有传代稳定性，为体外研究病毒的致病机理、开发新型疫苗等提供了有效的工具；本发明专利技术利用5’添加的CMV启动子，在细胞内进行转录，利用3’添加的HDVR序列，大大提高了病毒的拯救效率。

Method for rapidly constructing reverse genetic strain of avian infectious bronchitis virus

The invention discloses a method for rapidly constructing a reverse genetic strain of avian infectious bronchitis virus, belonging to the reverse genetic technology field of the coronavirus. The construction method comprises the following steps: using the BAC vector as the backbone in vitro using homologous recombination technique, including the construction of the rapid cloning of avian infectious bronchitis virus genome cDNA, the recombinant plasmid was directly transfected cells, transcription in cells infected with the transcription of the virus, and complete the package, the cells and culture medium the mixture of SPF chicken inoculated and passaged to obtain the reverse of avian infectious bronchitis virus genetic strains. The construction method has the advantages of simple operation, high rate of positive clones, and reverse genetic strains with genetic stability, provides an effective tool for the study of pathogenic mechanism, the development of new vaccine virus in vitro; the invention uses 5 \add CMV promoter transcription in cells, using HDVR sequence 3 'added. Greatly improve the virus rescue efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法
本专利技术涉及冠状病毒反向遗传
，具体涉及一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法。
技术介绍
禽传染性支气管炎(avianinfectiousbronchitis,IB)是危害养禽业的重大传染病之一，它是由禽传染性支气管炎病毒(avianinfectiousbronchitisvirus,IBV)引起的一种高度接触性传染病，以呼吸道症状、产蛋鸡产蛋量下降、蛋品质下降、肾脏病变及胃肠道病变为主要特征。IBV在全球流行，并且由于不同IBV毒株在致病性和组织嗜性上差异大，血清型极其复杂，不同的血清型之间缺乏有效的交叉保护，加上新的变异株不断出现，导致IBV的防控非常困难。IB的病原IBV属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属中的γ属冠状病毒的成员。病毒粒子略呈球形，有的呈多形性，直径约为80-120nm。基因组为不分节段的单股正链RNA，与核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)结合形成螺旋状的核衣壳；其外包裹一层由膜蛋白(Membrane,M)构成的囊膜；小分子蛋白(Envelope,E)镶嵌于囊膜中；由S1和S2两个亚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法，包括以下步骤：(1)根据禽传染性支气管炎病毒基因组序列以及BAC载体多克隆位点，设计n对含有同源臂的引物，以禽传染性支气管炎病毒RNA反转录产物cDNA为模板，分别扩增出基因组序列的n个片段，命名为f1、F2、…Fn‑1、fn，n为偶数，n≥4，其中F2～Fn‑1的首尾部分序列与相邻片段重复；利用体外同源重组技术，分别将上述扩增片段克隆到BAC载体上，获得亚克隆载体pBAC‑f1、pBAC‑F2、...pBAC‑Fn‑1、pBAC‑fn；(2)以含有巨细胞病毒启动子序列的质粒为模板，扩增得到含有同源臂的CMV序列，利用体外同源重组技术，将其融合...

【技术特征摘要】
1.一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法，包括以下步骤：(1)根据禽传染性支气管炎病毒基因组序列以及BAC载体多克隆位点，设计n对含有同源臂的引物，以禽传染性支气管炎病毒RNA反转录产物cDNA为模板，分别扩增出基因组序列的n个片段，命名为f1、F2、…Fn-1、fn，n为偶数，n≥4，其中F2～Fn-1的首尾部分序列与相邻片段重复；利用体外同源重组技术，分别将上述扩增片段克隆到BAC载体上，获得亚克隆载体pBAC-f1、pBAC-F2、...pBAC-Fn-1、pBAC-fn；(2)以含有巨细胞病毒启动子序列的质粒为模板，扩增得到含有同源臂的CMV序列，利用体外同源重组技术，将其融合到pBAC-f1基因组序列的5’端，获得亚克隆载体pBAC-F1；(3)克隆丁型肝炎核酶序列和牛生长激素聚腺苷酸化信号序列，融合PCR获得HB序列；以所述HB序列为模板，扩增得到含有同源臂的HB序列，利用体外同源重组技术，将HB序列融合到pBAC-fn基因组序列的3’端，获得亚克隆载体pBAC-Fn；(4)将pBAC-F1、pBAC-F2、...pBAC-Fn-1、pBAC-Fn依次两两配对，每对中，取其中一个亚克隆载体作为模板，扩增出含有同源臂的目的片段，利用体外同源重组技术，将目的片段融合到另一个亚克隆载体上，获得相邻两片段融合的亚克隆载体pBAC-F1F2、…pBAC-Fn-1Fn；(5)再按照步骤(4)的方法，将相邻的两个亚克隆载体进行融合，重复若干次，获得包含禽传染性支气管炎病毒基因组全长cDNA的克隆载体pBAC-IBV；(6)将克隆载体pBAC-IBV转染细胞，培养、收集培养基及细胞混合物，反复冻融，获得P0代拯救毒；(7)将P0代拯救毒接种SPF鸡胚，传代、获得所述禽传染性支气管炎病毒反向遗传株。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，选择pBAC-f1、pBAC-F2、...pBAC-Fn-1、...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖敏，周继勇，石婷婷，曹尚尚，颜焰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33