一种无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法技术

本发明专利技术公开了一种无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法。该无外源标记基因的抗PCV2转基因猪是通过将目的基因(抗PCV2 siRNA序列)与外源标记基因(Neo/EGFP融合表达基因)构建共表达载体，并通过转染、体细胞克隆等技术获得F0代抗PCV2转基因猪，并将获得的F0代转基因猪进行配种获得F1抗PCV2转基因猪，对F1代抗PCV2转基因猪进行鉴定，筛选出合适的F1转基因猪提取耳皮成纤维细胞，进行建系，并用HTNCre重组酶筛选出删除了Neo/EGFP外源标记基因的细胞系，并利用该细胞系进行体细胞克隆，最终获得无外源标记基因的抗PCV2转基因猪。该转基因猪删除了外源标记基因，减少了外源基因对转基因猪个体健康的影响，同时也可以简化转基因猪安全评价程序，有利于该转基因猪的产业化推广及应用。

Method for preparing anti PCV2 transgenic pig without exogenous marker gene

The invention discloses a preparation method of an anti PCV2 transgenic pig without an exogenous marker gene. The absence of exogenous marker gene PCV2 resistant transgenic pig by the gene (anti PCV2 sequence of siRNA gene and exogenous marker (Neo/EGFP) fusion gene expression) to construct the co expression vector, F0 generation of anti PCV2 transgenic pig by transfection, somatic cell cloning technology, F0 transgenic pig and the breeding F1 anti PCV2 transgenic pig, the F1 generation of anti PCV2 transgenic pigs were identified and screened out the suitable F1 extraction of transgenic pig ear skin fibroblasts, were built, and the recombinant HTNCre enzyme screening marker gene deleted Neo/EGFP exogenous cell lines and somatic cell cloning using this cell line, finally obtained anti PCV2 transgenic pigs without exogenous marker gene. The transgenic pig deleted exogenous marker gene, reduce the influence of exogenous genes on the transgenic pigs to individual health, but also can simplify the procedure of safety assessment of transgenic pigs, is conducive to the promotion of industrialization and application of the transgenic pigs.

【技术实现步骤摘要】
一种无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法
本专利技术涉及基因工程领域，特别涉及一种无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法。
技术介绍
在家畜动物的生长及疾病防治中，转基因技术日趋成熟，为便于转基因细胞系的筛选及转基因动物的检测，在转入目的基因的同时，常常同时转入外源标记基因，而EGFP绿色荧光蛋白可以在荧光显微镜下直接观察，而常常作为一种标记基因；Neo基因是一种抗生素抗性基因，细胞表达该基因可以灭活氨基糖甙类抗生素，破坏G418，而常常作为一种筛选标记基因用于转基因单克隆细胞的筛选。因而这两种基因无可避免的会出现在转基因动物中，而转基因动物成功获得后这些标记基因便不再需要了。同时，外源标记基因的存在将会对转基因家畜的健康将产生不良的影响，且我国转基因安全评价政策明文规定将标记基因等同于目的基因，同样必须经过复杂的安全评价，这无疑直接影响了转基因家畜的推广和产业化进程。因此，在进行转基因的操作中，通常在标记基因的两侧各加上一个相同的LoxP序列，以便在富集转基因成功的细胞后利用Cre/LoxP系统将转基因细胞内多余的标记基因删除。猪圆环病毒，属于圆环病毒科，为单股环状DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)、构建抗PCV2表达载体，所述的载体包含目的基因抗PCV2的siRNA表达基因序列和标记基因序列；(2)、筛选可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系；(3)、将获得的单克隆转基因细胞系作为核供体细胞，进行体细胞核移植获得F0代抗PCV2的转基因猪；(4)、将所述的F0代抗PCV2的转基因猪与母猪杂交繁育获得能稳定遗传的抗PCV2的F1代转基因猪；(5)、筛选所述的F1代转基因猪个体并进行外源基因整合位点分析；(6)、对筛选出的F1代转基因猪个体采取耳皮成纤维细胞，并进行耳皮成纤维细胞系的建立；(7)、删除细胞外源标记基因...

【技术特征摘要】
1.一种无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)、构建抗PCV2表达载体，所述的载体包含目的基因抗PCV2的siRNA表达基因序列和标记基因序列；(2)、筛选可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系；(3)、将获得的单克隆转基因细胞系作为核供体细胞，进行体细胞核移植获得F0代抗PCV2的转基因猪；(4)、将所述的F0代抗PCV2的转基因猪与母猪杂交繁育获得能稳定遗传的抗PCV2的F1代转基因猪；(5)、筛选所述的F1代转基因猪个体并进行外源基因整合位点分析；(6)、对筛选出的F1代转基因猪个体采取耳皮成纤维细胞，并进行耳皮成纤维细胞系的建立；(7)、删除细胞外源标记基因，再建立细胞单克隆，并进行体细胞克隆获得F2代无外源标记基因的抗PCV2的转基因猪。2.根据权利要求1所述的无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法，其特征在于所述的外源标记基因为Neo/EGFP融合表达基因。3.根据权利要求1所述的无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法，其特征在于步骤(4)所述的母猪为与所述的F0代抗PCV2的转基因猪同品种且遗传背景一致的野生型母猪。4.根据权利要求1所述的无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法，其特征在于步骤(5)中筛选的F1代转基因猪个体主要具有如下特征：能高效特异表达抗PCV2siRNA；目的基因抗PCV2siRNA序列整合位点单一且能稳定遗传。5.根据权利要求1所述的无外源标记基因的抗PCV2转基因猪制备方法，其特征在于步骤(7)中删除细胞外源标记基因是利用HTNCre重组酶来实现的，具体步骤为：(1)、复苏F1代抗PCV2转基因猪耳皮成纤维细胞；(2)、待细胞生长状态良好时，用HTNCre重组酶处理细胞系；(3)、24h后，对处理后的细胞系进行传代培养，并在显微...

【专利技术属性】
技术研发人员：李紫聪，黄晓灵，吴珍芳，刘德武，蔡更元，郑恩琴，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44