表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体。通过PEDV的M和N基因片段，利用Blunt‑M2表达载体，通过无缝克隆技术，构建出表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体，并在工程细胞中表达M+N双基因融合蛋白。本发明专利技术是直接将纯化PEDV的M基因片段连接到Blunt‑M2哺乳动物真核表达载体中，不需要连接至单克隆载体PMD19‑T中，然后M+Blunt‑M2质粒通过同源重组技术，无缝拼接N基因片段，从而获得M+N双基因融合表达载体，其质粒通过PCR技术进行鉴定，测序准确后再转染在细胞中获得成功表达。因此，该真核表达载体的制备比较其他真核表达技术，具有操作步骤简单、反应时间短等特点，适合双基因融合蛋白表达。

【技术实现步骤摘要】
表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体。
技术介绍
猪流行性腹泻(PED)由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起猪群呕吐、腹泻、脱水及死亡为特征的消化道病毒性疾病。该病于1971年首次在英国报道，我国在1984年证实该病在的存在。自2010年下半年以来，由于传统的PEDV在基因上发生了缺失、插入及变异，导致该病对猪群的致病性增强，造成了大量的猪群发病死亡，损失惨重。目前世界上大多数养猪国家都有发生变异PEDV的报道，尤其以中国、韩国、日本、泰国和美国等国家发病严重，给养猪业造成了巨大的经济损失，并已成为影响全球养猪业健康发展的重要疫病之一。PEDV的基因组长大约在28000bp左右，主要含有4个结构蛋白，分别为S、M、N及E蛋白。目前，已见通过PEDV的单个基因如N、S及M基因段片，通过原核表达方法表达出单基因蛋白，但未见通过PEDV的M和N基因片段，利用Blunt-M2哺乳动物真核表达载体，通过无缝拼接技术，构建出表达PEDV的M+N的双基因真核表达载体。因此，一种表达PEDV的M+N双基因的真核表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)根据PEDV的M、N基因及pEASY‑Blunt‑M2表达载体基因的片段序列，设计与合成特异性引物；(2)以PEDV的cDNA为模板，通过PCR技术分别扩增出M与N基因片段，并进行回收纯化，将纯化的M基因片段连接到pEASY‑Blunt‑M2表达载体上，构建出M+Blunt‑M2质粒；(3)以M+Blunt‑M2质粒为模板，扩增质粒的基因片段，回收纯化M+Blunt‑M2基因片段；(4)采用pEASY‑Uni Seamless Cloning and Assembly kit，通过无缝克隆技术将M+Blun...

【技术特征摘要】
1.一种表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)根据PEDV的M、N基因及pEASY-Blunt-M2表达载体基因的片段序列，设计与合成特异性引物；(2)以PEDV的cDNA为模板，通过PCR技术分别扩增出M与N基因片段，并进行回收纯化，将纯化的M基因片段连接到pEASY-Blunt-M2表达载体上，构建出M+Blunt-M2质粒；(3)以M+Blunt-M2质粒为模板，扩增质粒的基因片段，回收纯化M+Blunt-M2基因片段；(4)采用pEASY-UniSeamlessCloningandAssemblykit，通过无缝克隆技术将M+Blunt-M2基因与N基因片段进行重组连接，将连接产物再转化至Trans1-T1感受态细胞中，涂布于氨苄青霉素抗性的LB培养基进行培养后，提取M+Blunt-M2+N质粒进行测序鉴定，得到表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体。2.根据权利要求1所述的表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体的制备方法，其特征在于：所述PEDV为变异猪流行性腹泻病毒。3.根据权利要求1所述的表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述特异性引物序列如下：a、MM-F:ATGTCTAACGGTTTTATTCCM-R:GACTAAATGAAGCACTTTCTb、M2+MM2+M-F:AAGGGCGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：王隆柏，周伦江，吴学敏，陈秋勇，王晨燕，车勇良，刘玉涛，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35