用转基因斑马鱼检测具乙酰胆碱酯酶抑制活性物质的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用转基因斑马鱼检测具乙酰胆碱酯酶抑制活性物质的方法。本发明专利技术构建了tg(‑6kb hspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)转基因斑马鱼，可利用其检测待测物质是否为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质，检测待测水体是否被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染。实验证明其能够用于评价乙酰胆碱酯酶抑制剂导致斑马鱼体内所产生的生物效应，由于其是一种基于斑马鱼hspb11基因的上游调控序列调控报告基因即荧光蛋白编码基因表达的检测方法，因而具有简单、快速和廉价的特点；另外，对具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的化学物质具有特异性和敏感性；且适用于对含有乙酰胆碱酯酶抑制剂的水溶液进行检测。

【技术实现步骤摘要】
用转基因斑马鱼检测具乙酰胆碱酯酶抑制活性物质的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种利用转基因斑马鱼检测具乙酰胆碱酯酶抑制活性物质的方法。
技术介绍
乙酰胆碱酯酶是降解乙酰胆碱的水解酶。乙酰胆碱酯酶存在于神经传导组织和红细胞膜，在神经细胞突触和神经肌肉接点-运动终板的发育过程中具有重要作用。乙酰胆碱酯酶抑制剂通过抑制乙酰胆碱水解酶活性阻断神经之间，神经和肌肉间的信号传递，影响神经和运动功能并导致动物瘫痪和死亡。乙酰胆碱酯酶抑制剂被广泛应用于治疗阿尔茨海默病、神经毒剂和杀虫剂(沙林、VX毒气、有机磷和氨基甲酸类农药等)。由于有机磷农药具有毒性强、毒性效应广、在环境中可快速降解等特点，被广泛应用于农业生产和作为室内外杀虫剂。有机磷和氨基甲酸类农药的广泛使用对食物、水和土壤的污染引起了公众对健康影响的关注，对生态环境安全的担忧。评价乙酰胆碱酯酶抑制剂类物质对人类健康和环境的影响效应，研究、专利技术特异性好，高效的检测乙酰胆碱酯酶抑制剂类物质的方法和技术成为关键。检测环境中乙酰胆碱酯酶抑制剂的水平已经被广泛用做土壤、水环境中有机磷农药的动物暴露水平和导致动物生理效应的评价指标。分析化学技本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用转基因斑马鱼检测待测物质是否为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质的方法，包括如下步骤：(A1)向转基因斑马鱼的培养体系中加入不同浓度的待测物质，使培养体系中所述待测物质的浓度呈现一定的浓度梯度，经过24‑72小时暴露，检测所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值，记录经不同浓度的所述待测物质暴露诱导的所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值；所述转基因斑马鱼为转基因斑马鱼A或转基因斑马鱼B；所述转基因斑马鱼A为向受体斑马鱼中转入修饰后的BAC DNA，经过同源重组后得到的；所述修饰后的BAC DNA是将斑马鱼BAC DNA中的hspb11基因的外显子部分替换为含有荧光蛋白编...

【技术特征摘要】
1.一种利用转基因斑马鱼检测待测物质是否为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质的方法，包括如下步骤：(A1)向转基因斑马鱼的培养体系中加入不同浓度的待测物质，使培养体系中所述待测物质的浓度呈现一定的浓度梯度，经过24-72小时暴露，检测所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值，记录经不同浓度的所述待测物质暴露诱导的所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值；所述转基因斑马鱼为转基因斑马鱼A或转基因斑马鱼B；所述转基因斑马鱼A为向受体斑马鱼中转入修饰后的BACDNA，经过同源重组后得到的；所述修饰后的BACDNA是将斑马鱼BACDNA中的hspb11基因的外显子部分替换为含有荧光蛋白编码基因的片段后得到的；所述转基因斑马鱼B为向受体斑马鱼中转入含有目的DNA片段的重组质粒后得到的，所述目的DNA片段自上游到下游依次含有hspb11基因6kb上游调控序列、荧光蛋白编码基因及抗性筛选标记基因；(A2)如果经过不同浓度的所述待测物质暴露后，存在至少一个浓度使得所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值显著高于本底值，则所述待测物质为或候选为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质；反之，则所述待测物质不为或候选不为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质；所述本底值为没有加入所述待测物质的所述转基因斑马鱼培养体系中培养的所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值。2.一种检测待测水体是否被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染的方法，包括如下步骤：(B1)用同一常数稀释因子稀释待测水体为不少于5个浓度，在转基因斑马鱼培养体系中分别加入所述不少于5个浓度的所述待测水体，24-72小时后检测所述转基因斑马鱼肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值；所述转基因斑马鱼为转基因斑马鱼A或转基因斑马鱼B；所述转基因斑马鱼A为向受体斑马鱼中转入修饰后的BACDNA，经过同源重组后得到的；所述修饰后的BACDNA是将斑马鱼BACDNA中的hspb11基因的外显子部分替换为含有荧光蛋白编码基因的片段后得到的；所述转基因斑马鱼B为向受体斑马鱼中转入含有目的DNA片段的重组质粒后得到的，所述目的DNA片段自上游到下游依次含有hspb11基因6kb上游调控序列、荧光蛋白编码基因及抗性筛选标记基因；(B2)如果步骤(B1)的检测中存在任何一个浓度导致所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值显著高于本底值，则所述待测水体被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染或疑似被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染；反之，则所述待测水体未被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染；所述本底值为没有加入待测水体的所述转基因斑马鱼的培养体系中培养的所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨立新，曾晨，赵秀阁，
申请(专利权)人：中国环境科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11