利用一阶导数紫外分光光度法测定壳寡糖脱乙酰度的方法技术

本发明专利技术提供一种利用一阶导数紫外分光光度法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，包括如下步骤：1)以浓度为0.3‑1.0mol/L的盐酸溶液作为空白溶剂，建立标准曲线；2)取壳寡糖样品，用空白溶剂溶解后，以空白溶剂为参比，在200‑206nm波长处测定其吸光度值，根据标准曲线计算其脱乙酰度。本发明专利技术提供的利用一阶导数紫外分光光度法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，操作简单易行，可消除共存物、浊度及色度的干扰，准确度和精密度高，实用性强。本发明专利技术提供的壳寡糖脱乙酰度的测定方法简单、快速、准确，有助于壳寡糖制备过程中的质量控制。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于化学领域，尤其涉及一种利用一阶导数紫外分光光度法测定壳寡糖脱乙酰度的方法。
技术介绍
甲壳素是地球上仅次于纤维素的第二大生物多糖，主要存在于虾、蟹、昆虫的甲壳，真菌、植物的细胞壁，动物的关节等坚硬部分以及肌肉与骨结合处等。壳寡糖(COS)是氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的同聚物或异聚物，由甲壳素降解而来。甲壳素的N-乙酰基脱去55％以上即为壳聚糖(CTS)，CTS继续降解至2-10个聚合度即为COS。实际生产中，20个聚合度(约3kDa)的分子也被称为COS。与壳聚糖相比，壳寡糖具有溶解性更好，粘度更低更易被人体吸收的优点，在医药、农业、精细化工等领域有着广泛的应用。壳寡糖不仅具有抗肿瘤、抑菌抗菌、抗氧化等功能，还具有减肥、调脂、增强免疫力等生物功能。壳寡糖的研究和开发是目前的研究热点。壳寡糖的脱乙酰度是指在壳寡糖中总的糖残基数中脱除乙酰基的糖残基数所占的百分比，能够影响壳寡糖的生物、物理、化学功能与活性，是壳寡糖各种功能的体现，是衡量壳寡糖质量的重要指标之一。目前，已有较多成熟的方法应用于测定壳聚糖的脱乙酰度，如：2015年版《中华人民共和国药典》第四部第511-512页公开了甲基橙酸碱指示剂法测定壳聚糖脱乙酰度的方法；欧洲药典(European Pharmacopeia8.0[M].EDQM,2014:1841-1842)公开了以纯化水为溶剂，利用一阶导数紫外分光光度法测定壳聚糖脱乙酰度的方法。中国专利申请201310587162.5公开了一种测定壳聚糖与壳寡糖混合物的脱乙酰度的方法，包括如下步骤：将待检测的样品用稀盐酸溶解，同时以全脱乙酰化壳寡糖为内标，分别测定在199nm的紫光下吸光度，并根据标准曲线，得到样品脱乙酰度，检测过程中以0.001mol/L的盐酸溶液作为溶剂。壳聚糖和壳寡糖，由于两者在性质上存在较大的差异，因此壳聚糖脱乙酰度的测定方法并不一定适用于壳寡糖脱乙酰度的测定。根据2015年版《中华人民共和国药典》第四部中壳聚糖脱乙酰度的测定方法测定壳寡糖的脱乙酰度时，指示剂甲基橙pH变色范围在3.1-4.4，酸式色为红色，碱式色为黄色，一方面，壳寡糖样品水溶液本身呈现淡黄色，采用甲基橙作为指示剂，使得滴定终点无法准确判断；另一方面，壳寡糖等电点值在4.80左右，超出甲基橙pH变色范围，因此，按照2015版《中国药典》采用甲基橙酸碱指示剂法测定的壳寡糖脱乙酰度存在滴定终点颜色变化不明显，重现性差，误差较大的缺点。参照欧洲药典测定壳聚糖脱乙酰度的方法以水或者0.001mol/L的盐酸溶液作为溶剂测定壳寡糖脱乙酰度时，壳寡糖无最大吸收波长，因此，欧洲药典公开的一阶导数紫外分光光度法无法适用于壳寡糖脱乙酰度的测定。核磁共振氢谱(1H-NMR)作为测定壳聚糖脱乙酰度的金标准，已载入了美国药典，同时，Kim等发表的论文“Oligosaccharides and Their Derivatives”和王世欣等发表的论文“不同来源的壳寡糖产品的质量分析”公开了可利用核磁共振氢谱法测定壳寡糖的脱乙酰度，测定结果误差小。但1H-NMR方法由于其仪器成本高且操作需要专业的技术人员，因而无法广泛推广使用。目前国内外尚未建立测定壳寡糖脱乙酰度的标准方法。因此，有必要建立一种快速、方便并且准确的测定壳寡糖脱乙酰度的方法。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，专利技术人进行了大量的试验和研究，意外地发现：采用一阶导数紫外分光光度法测定壳寡糖脱乙酰度时，若采用盐酸浓度达到0.30mol/mL及以上的稀盐酸作为溶剂，壳寡糖有最大波长。基于上述发现，从而完成本专利技术。本专利技术的目的将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。本专利技术提供一种利用一阶导数紫外分光光度法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，包括如下步骤：1)以浓度为0.3-1.0mol/L的盐酸溶液作为空白溶剂，配置一系列浓度的N-乙酰-D-葡萄糖胺标准溶液，以空白溶剂为参比，测定不同浓度的N-乙酰-D-葡萄糖胺标准溶液在200-206nm波长范围内的紫外吸光度值A，根据N-乙酰-D-葡萄糖胺的浓度和ΔA/Δλ绘制标准曲线，其中，ΔA＝Aλ+1—Aλ-1，λ为203-205nm，Δλ＝2nm；2)取壳寡糖样品，用空白溶剂溶解后，以空白溶剂为参比，在200-206nm波长处测定其紫外吸光度值，根据标准曲线计算壳寡糖样品中N-乙酰-D-葡萄糖胺的浓度，并根据以下公式计算壳寡糖样品的脱乙酰度：式中，D.D％为脱乙酰度，％；C1为壳寡糖样品浓度，μg/mL；C2为壳寡糖样品中N-乙酰-D-葡萄糖胺的浓度，μg/mL；M1为203，N-乙酰-D-葡萄糖胺的分子量；42为N-乙酰-D-葡萄糖胺的分子量与D-氨基葡萄糖胺的分子量之差。优选地，所述空白溶剂的浓度为0.3mol/L。优选地，步骤1)中，N-乙酰-D-葡萄糖胺标准溶液的浓度分别为1.60μg/mL、20.0μg/mL、32.0μg/mL、40.0μg/mL、64.0μg/mL、80.0μg/mL。优选地，步骤1)中，λ为204nm。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术提供的利用一阶导数紫外分光光度法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，以浓度为0.3-1.0mol/L的盐酸溶液作为溶剂，采用一阶导数紫外分光光度法，通过测定样品中的N-乙酰-D-葡萄糖胺的含量，直接测定壳寡糖的脱乙酰度，测定结果在0.0016-0.08mg/mL范围内呈良好的线性(R2＝0.9992)，相对标准偏差为0.19％-0.27％，回收率为99.5％-100.3％；同时，与1H-NMR法的测定结果相比，相对误差控制在0.08％以内，说明本专利技术提供的壳寡糖脱乙酰度测定方法准确度高，实用性强。(2)本专利技术提供的利用一阶导数紫外分光光度法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，消除了共存物D-氨基葡萄糖胺、浊度及色度的干扰，提高了测定结果的准确度和灵敏度，样品不需要特殊的处理，操作简单易行。(3)本专利技术提供的利用一阶导数紫外分光光度法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，同一样品测定结果的相对标准偏差(RSD)控制在0.04％以内，说明本专利技术提供的壳寡糖脱乙酰度测定方法重现性好，精密度好。附图说明图1以纯化水为溶剂，N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-氨基葡萄糖胺、COSMW1000和COSMW3000在200nm-400nm范围内的紫外吸收光谱。图2以不同浓度的盐酸溶液为溶剂，COSMW1000在200nm-400nm范围内的紫外吸收光谱。图3以不同浓度的盐酸溶液为溶剂，COSMW3000在200nm-400nm范围内的紫外吸收光谱。图4以0.30mol/L盐酸溶液为溶剂，N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-氨基葡萄糖胺、COSMW1000和COSMW3000在200nm-400nm范围内的紫外吸收光谱。图5 N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-氨基葡萄糖胺、COSMW1000和COSMW3000在200-210nm范围内的紫外一阶导数光谱。图6一阶导数紫外分光光度法标准曲线。图7 COSMW1000的核磁共振氢谱图(500MHz)，其中，A-E代表糖环上C2-C6位氢信号。图8 COSMW3000的核磁共振氢谱图(500MH本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用一阶导数紫外分光光度法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)以浓度为0.3‑1.0mol/L的盐酸溶液作为空白溶剂，配置一系列浓度的N‑乙酰‑D‑葡萄糖胺标准溶液，以空白溶剂为参比，测定不同浓度的N‑乙酰‑D‑葡萄糖胺标准溶液在200‑206nm波长范围内的紫外吸光度值A，根据N‑乙酰‑D‑葡萄糖胺的浓度和ΔA/Δλ绘制标准曲线，其中，ΔA＝Aλ+1—Aλ‑1，λ为203‑205nm，Δλ＝2nm；2)取壳寡糖样品，用空白溶剂溶解后，以空白溶剂为参比，在200‑206nm波长处测定其紫外吸光度值，根据标准曲线计算壳寡糖样品中N‑乙酰‑D‑葡萄糖胺的浓度，并根据以下公式计算壳寡糖样品的脱乙酰度：式中，D.D％为脱乙酰度，％；C1为壳寡糖样品浓度，μg/mL；C2为壳寡糖样品中N‑乙酰‑D‑葡萄糖胺的浓度，μg/mL；M1为203，N‑乙酰‑D‑葡萄糖胺的分子量；42为N‑乙酰‑D‑葡萄糖胺的分子量与D‑氨基葡萄糖胺的分子量之差。

【技术特征摘要】
1.一种利用一阶导数紫外分光光度法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)以浓度为0.3-1.0mol/L的盐酸溶液作为空白溶剂，配置一系列浓度的N-乙酰-D-葡萄糖胺标准溶液，以空白溶剂为参比，测定不同浓度的N-乙酰-D-葡萄糖胺标准溶液在200-206nm波长范围内的紫外吸光度值A，根据N-乙酰-D-葡萄糖胺的浓度和ΔA/Δλ绘制标准曲线，其中，ΔA＝Aλ+1—Aλ-1，λ为203-205nm，Δλ＝2nm；2)取壳寡糖样品，用空白溶剂溶解后，以空白溶剂为参比，在200-206nm波长处测定其紫外吸光度值，根据标准曲线计算壳寡糖样品中N-乙酰-D-葡萄糖胺的浓度，并根据以下公式计算壳寡糖样品的脱乙酰度：式中，D.D％为脱乙酰度，％；C1为壳寡糖样品浓度，μg/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏政权，郭姣，蒋瑶，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44