一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂、试剂盒及其方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂，其包括含有SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：2所示序列的捕获引物的裂解液；本发明专利技术还涉及包括上述核酸提取试剂的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括冻干粉型荧光PCR反应体系，该反应体系包括如SEQ ID NO：3‑SEQ ID NO：4所示序列的结核分枝杆菌扩增引物和如SEQ ID NO：5所示的结核分枝杆菌扩增探针、冻干骨架、冻干保护剂、dNTPs和酶混合液。本发明专利技术通过优化结核分枝杆菌核酸的提取过程，尽量减少对荧光PCR产生的干扰物质，能够针对多种样本应用荧光PCR技术完成对低拷贝结核分枝杆菌核酸的检测；同时通过将结核分枝杆菌检测体系冻成干粉状，最大程度上增加荧光PCR的上样量，增强了结核分枝杆菌的检测出率。

Nucleic acid extraction reagent, kit and method for detecting low copy Mycobacterium tuberculosis

The invention relates to a method for the detection of low copy DNA of Mycobacterium tuberculosis extraction reagent, which contains SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 sequences shown to capture primer lysate; the present invention relates to a kit and detection method for extracting the nucleic acid, the kit includes a freeze-dried powder fluorescent PCR reaction system, the reaction system including Mycobacterium tuberculosis such as SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 shows sequence amplification primers and Mycobacterium tuberculosis SEQ ID NO:5 shows the amplification of the probe and freeze-dried skeleton, cryoprotector, dNTPs and enzyme mixture. The present invention through the extraction process optimization of Mycobacterium tuberculosis, minimize the interference substances produced on the fluorescence of PCR, according to various samples by the fluorescence PCR technique to detect low copy of Mycobacterium tuberculosis; the detection system of Mycobacterium tuberculosis frozen dry powder, which maximizes the amount of sample fluorescence PCR and enhance the rate of detection of Mycobacterium tuberculosis.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂、试剂盒及其方法
本专利技术涉及分子生物学领域和临床检测诊断领域，尤其涉及一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂、试剂盒及其方法。
技术介绍
我国是世界上22个结核病高疫情国家之一，患者数居世界第2位，感染率为44.5％，活动性肺结核患者为450万例，每年新发病例约100万左右，死亡人数达13万例每年，是其他传染病死亡人数的2倍以上。目前针对结核的诊断方法主要包括痰涂片抗酸染色、痰培养方法、结核分枝杆菌核酸检测和干扰素释放试验等，虽然这些技术已经在临床检测和对结核分枝杆菌感染的监测等方面被广泛应用，但检出率相对较低，检出时间长，操作过程复杂，易受到其他疾病干扰等因素影响，这些检测手段已不能满足临床需求。目前，临床上对菌阴性肺结核(指患者在进行痰液涂片时或是在进行一次的痰液培养阴性的活动性肺结核)缺乏相对可靠的检测方法，菌阴性肺结核在初期属于非传染性结核病，但若对于部分体质较差的患者，多表现为与呼吸道症状相似的临床症状，如咳嗽、咳痰及严重者出现咯血的症状，故多数患者因误诊而导致病情加重，最终因为治疗延误使其转为阳性肺结核。市场上已经有多种商业化的分枝杆菌结核核酸检测试剂产品，但由于诸多因素限制因素使得其检出符合率与临床诊断结果相差很大，这些因素主要包括：1)样本质量达不到检测要求；2)对MTB-DNA提取能力较差，不能完全富集样本中的MTB-DNA，使得检测结果不理想；3)试剂盒敏感性不够；4)目前大部分检测产品为液体试剂，其对运输过程要求较高，实际运输中很难完全按照要求运送，导致试剂盒的检测性能有所降低；5)常规的检测试剂产品还不能准确地对外周血中的结核DNA进行检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的试剂盒及其方法，该方法从根本上解决现有结核分枝杆菌核酸检测试剂盒敏感性低，稳定性差、检测样本单一和对运输温度要求高等问题。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂，其包括裂解液，所述裂解液含有SEQIDNO：1-SEQIDNO：2所示序列的捕获引物。优选地，所述核酸提取试剂还包括液化液、蛋白酶K、磁珠液、洗涤液和洗脱液。优选地，所述捕获引物5’端采用生物素标记。优选地，所述裂解液含有：50～200mM氯化钠、30～60mM三羟甲基氨基甲烷、0.5～2％十二烷基磺酸钠、1～5mM乙二胺四乙酸、1～5mM氯化钙和1～10nM捕获引物。本专利技术还提供一种包含如上所述的核酸提取试剂的用于检测低拷贝结核分枝杆菌的试剂盒。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括：优选地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。优选地，所述试剂盒还包括荧光PCR反应体系，所述荧光PCR反应体系为冻干粉型荧光PCR反应体系，其包括如SEQIDNO：3-SEQIDNO：4所示序列的结核分枝杆菌扩增引物和如SEQIDNO：5所示序列的结核分枝杆菌扩增探针；其中，所述探针的5’端连接有荧光基团，所述荧光基团为FAM、ROX、HEX、CY5、CY3、TET、ALEX或CALFlour；所述探针的3’端连接有淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2或DABCYL；更优选地，所述探针的5’端连接荧光基团FAM，所述探针的3’端连接淬灭基团BHQ1。优选地，所述荧光PCR反应体系还包括冻干骨架、冻干保护剂、dNTPs和酶混合液。优选地，所述荧光PCR反应体系为30～100μL。优选地，所述冻干骨架包括0.3％～2.5％甲基纤维素和/或羟甲基纤维素，和/或含有1％～5％聚乙烯吡咯烷酮。优选地，所述冻干保护剂包括2％～5％海藻糖和/或1％～10％蔗糖。优选地，所述dNTPs包括0.1～0.5mM的dNTP和dUT。优选地，所述酶混合液包括1.5～5UTaqDNA聚合酶、UNG酶和缓冲液。上述引物及探针的核苷酸序列如表1所示。表1引物及探针核苷酸序列表最后，本专利技术提供一种用于非诊断和治疗目的的采用上述试剂盒来来检测低拷贝结核分枝杆菌的方法，其包括如下所述的核酸提取步骤：采用核酸提取试剂对样本进行酶促消化、寡核苷酸杂交和捕获、结核DNA富集、洗涤和洗脱。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括：优选地，所述样本为痰液、灌洗液、外周血和脑脊液，当样本为痰液或灌洗液时，所述酶促消化之前先对样本进行液化。优选地，所述液化方法选自4％氢氧化钠(NaOH)、5-10％二硫代苏糖醇(DDT)、1.45％N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)、2％氢氧化钠(NaOH)、Saccomanno法、二硫苏糖醇(DTT)法、0.5％N-乙酸-L半胱氨酸、1.45％枸橼酸钠、2％氢氧化钠、0.25％胰蛋白酶(Trypsin)、400u/mL的胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)、高压液化法及其组合；更优选地，所述液化方法为1.45％N-乙酰-L-半胱氨酸及2％氢氧化钠(NALC-NaOH)的联合应用、Saccomanno法和二硫苏糖醇(DTT)法的联合应用、0.5％N-乙酸-L半胱氨酸和1.45％枸橼酸钠和2％氢氧化钠的液化剂振摇液化、4％氢氧化钠(NaOH)和5％二硫代苏糖醇(DDT)的联合应用。优选地，所述核酸提取步骤的具体过程如下：1)痰液和灌洗液样本需采用上述的液化方法进行预先液化，而外周血、脑脊液样本直接进入步骤2)。2)取0.5～1mL步骤1)处理后的样本，加入0.5～1倍体积裂解液和20mg/mL蛋白酶K，其中裂解液含有：50～200mM氯化钠、30～60mM三羟甲基氨基甲烷、0.5～2％十二烷基磺酸钠、1～5mM乙二胺四乙酸、1～5mM氯化钙和1～10nM捕获引物，所述的捕获引物的序列为SEQIDNO1和SEQIDNO2，捕获引物5’端采用生物素(biotin)标记；3)充分混匀后56℃消化30min；4)消化结束后95℃孵育10min，将蛋白酶K失活，随后将温℃维持在55℃孵育10min；5)加入10～50mg1～10μM链霉亲和素标记的超顺磁珠，充分混匀，孵育10min；6)将样本放置磁力架上，静置2～5min，吸去液体；7)加入200～500μL洗涤液，洗涤1～2次，所述的洗涤液中含有：10mM三羟甲基氨基甲烷和0.1～0.5mM乙二胺四乙酸，pH为8.0；8)加入30～100μL洗脱液，所述洗脱液即为PCR扩增模板DNA，混匀后备用，若不及时检测，保存于-20℃；9)阴性质控品和阳性质控品参照上述同样的方法进行处理。优选地，上述检测低拷贝结核分枝杆菌的方法还包括如下所述的荧光PCR扩增程度：1)将上述所获得的30～100μL含PCR扩增模板DNA的洗脱液直接加入到冻干粉型荧光PCR反应体系中，盖好管盖，上机反应；2)PCR扩增的最佳反应温度和时间为：UNG酶反应55℃2min，1个循环；Taq酶活化95℃10min，1个循环；变性95℃15s，退火、延伸、荧光采集55℃45s，45个循环；仪器冷却37℃2min，1个循环。优选地，上述检测低拷贝结核分枝杆菌的方法还包括上述荧光PCR反应的结果判读：荧光基团信号通路Ct值<42循环，且扩增曲线为“S”型，检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂，其特征在于，包括裂解液，所述裂解液含有SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：2所示序列的捕获引物。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂，其特征在于，包括裂解液，所述裂解液含有SEQIDNO：1-SEQIDNO：2所示序列的捕获引物。2.一种包含如权利要求1所述的核酸提取试剂的用于检测低拷贝结核分枝杆菌的试剂盒。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光PCR反应体系，所述荧光PCR反应体系为冻干粉型荧光PCR反应体系，其包括如SEQIDNO：3-SEQIDNO：4所示序列的结核分枝杆菌扩增引物和如SEQIDNO：5所示序列的结核分枝杆菌扩增探针。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光基团，所述荧光基团为FAM、ROX、HEX、CY5、CY3、TET、ALEX或CALFlour；所述探针的3’端连接有淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2或DABCYL。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR反应体系还包括冻干骨架、冻干保护剂、dNTPs和酶混合液。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述冻干骨架包括0.3％～2.5％甲基纤维素和/或羟甲基纤维素，和/或含有1％～5％聚乙烯吡咯烷酮；所述冻干保护剂包括2％～5％海藻糖和/或1％～10％蔗糖；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐飞虎，董振国，
申请(专利权)人：上海默礼生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31