本发明专利技术公开了用于早期诊断原发性肝癌的lncRNA基因标志物和试剂盒，由lncRNA MEG3和lncRNA PRNCR1组成。本发明专利技术提供的血浆lncRNA MEG3和lncRNA PRNCR1联合用于诊断原发性肝癌和非原发性肝癌(包括良性肝病和健康对照)的诊断性能优异，准确度和灵敏度高，特异性强，可以用于开发成早期诊断原发性肝癌的诊断试剂盒。
LncRNA gene markers and kits for early diagnosis of primary liver cancer
The invention discloses a lncRNA gene for early diagnosis of primary liver cancer markers and kit, consisting of lncRNA MEG3 and lncRNA PRNCR1. The invention provides a plasma lncRNA MEG3 and lncRNA PRNCR1 combination for the diagnosis of primary liver cancer and primary liver cancer (including benign liver diseases and healthy controls) in the diagnosis of excellent performance, high accuracy and sensitivity, specificity, can be used in the development of a diagnostic kit for early diagnosis of primary hepatocellular carcinoma.
【技术实现步骤摘要】
用于早期诊断原发性肝癌的lncRNA基因标志物和试剂盒
本专利技术属于基因诊断领域，具体涉及用于早期诊断原发性肝癌的lncRNA基因标志物。
技术介绍
原发性肝癌(primayhepaticcancer，PHC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在消化系统恶性肿瘤中居第三位，在世界上的发病率居第五位。原发性肝癌是高侵袭性的恶性肿瘤，早期症状不明显，导致大多数患者就诊较晚。中、晚期主要病征为右上腹疼痛、上腹胀满、发热、乏力、消瘦，晚期常有腹水、黄疸。在确诊时往往已属晚期，只有10％-30％患者能接受根治性切除手术，导致整体预后很差，一般平均存活时间只有3个月左右。这些患者大部分都是家庭经济支柱，因此，对个人、家庭及社会有很大影响，有效的预防、及早的诊断和有效的治疗十分重要。近年来，原发性肝癌治疗效果有所提高，一个很重要的原因就是以甲胎蛋白(AFP)为基础的血清学检测技术提高了早期诊断率，进而提高了患者的早期处理比例。但用AFP进行筛查有局限性，有20％-30％的原发性肝癌患者AFP呈阴性或低浓度水平。非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA，其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、miRNA及长链非编码RNA(LncRNA)。LncRNA是一类长度大于200碱基的RNA分子，由于缺少有效的开放式阅读框不编码蛋白，但具备复杂的生物学功能并在各种生物过程中发挥重要的作用，如染色质修饰、X染色体的失活、参与基因转录、翻译以及到蛋白活动调控等，其变异和调节能够导致包括肿瘤在内的多重疾病。异常表达的LncRNA可通过不同途径和不同作用机制参与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移的各个阶段，是肿瘤进展的关键因素。近年来研究表明异常表达的LncRNA通过多重途径参与了肿瘤细胞的凋亡、増殖、侵袭与转移等调控，与肝癌等肿瘤的发生与转移具有密切的关系。已有研究将组织或血液中的LncRNA作为疾病诊断的标志物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术对原发性肝癌早期诊断的不足，以及现有的甲胎蛋白法对部分原发性肝癌患者灵敏度和特异性低的缺陷，提供用于早期诊断原发性肝癌的lncRNA基因标志物，以用于制备早期诊断原发性肝癌的试剂盒。实现本专利技术上述目的技术方案如下：血浆lncRNA基因标志物在制备早期诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用，所述lncRNA基因标志物由lncRNAMEG3和lncRNAPRNCR1组成。一种引物组合物，用于测定血浆lncRNA基因标志物lncRNAMEG3和lncRNAPRNCR1的表达水平，包括SEQIDNO.1所示的lncRNAMEG3的上游引物、SEQIDNO.2所示的lncRNAMEG3的下游引物、SEQIDNO.3所示的lncRNAPRNCR1的上游引物和SEQIDNO.4所示的lncRNAPRNCR1的下游引物。优选地，所述的引物组合物还包括SEQIDNO.5所示的内参U6的上游引物和SEQIDNO.6所示的内参U6的下游引物。一种早期诊断原发性肝癌的试剂盒，包括上述引物组合物。优选地，所述的试剂盒还包括RT-PCR反应所需的酶和试剂。本专利技术的突出优点：本专利技术提供的lncRNA基因标志物lncRNAMEG3和lncRNAPRNCR1联合用于诊断原发性肝癌和非原发性肝癌(包括良性肝病和健康对照)的诊断性能优异，准确度和灵敏度高，特异性强，可以用于开发成早期诊断原发性肝癌的诊断试剂盒。附图说明图1为本专利技术血浆lncRNAMEG3和lncRNAPRNCR1联合用于诊断原发性肝癌和非原发性肝癌(包括良性肝病和健康对照)的ROC曲线图；图2为血浆lncRNAMEG3单独用于诊断原发性肝癌和非原发性肝癌(包括良性肝病和健康对照)的ROC曲线图；图3为血浆lncRNAPRNCR1单独用于诊断原发性肝癌和非原发性肝癌(包括良性肝病和健康对照)的ROC曲线图。具体实施方式下面就结合实施例具体介绍本专利技术的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。一、实验样本1、测试集样本122例各型肝病患者均为2014年3月至2015年3月间江苏省中西医结合医院门诊或住院患者，其中原发性肝癌组(PHC组)78例，良性肝病组44例(肝硬化14例，急性肝炎12例，慢性肝炎12例，脂肪肝6例)，原发性肝癌患者均经病理学或影像学检查证实。健康对照组36例，男20例，女16例，年龄20-84岁，平均年龄55.2±9.6岁，均为同期该院体检正常并排除其他慢性疾病的健康者。PHC组和非PHC组(包括良性肝病和健康对照)性别年龄无显著差异。2、验证集样本134例各型肝病患者均为2014年3月至2015年3月间南京医科大学第二附属医院门诊或住院患者，其中原发性肝癌组(PHC组)82例，良性肝病组52例(肝硬化14例，急性肝炎16例，慢性肝炎14例，脂肪肝8例)，原发性肝癌患者均经病理学或影像学检查证实。健康对照组42例，男20例，女22例，年龄21-82岁，平均年龄54.6±10.2岁，均为同期该院体检正常并排除其他慢性疾病的健康者。PHC组和非PHC组(包括良性肝病和健康对照)性别年龄无显著差异。所有样本收集过程中，肝病诊断标准和肿瘤诊断标准符合2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的“病毒性肝炎防治方案”中病毒性肝炎诊断标准及中华人民共和国卫生部2011年制定的《原发性肝癌诊疗规范》中的肝癌诊断标准。3、部分试剂Trizol试剂，美国Invitrogen公司；PrimeScriptTMRTreagentKit，日本TaKaRa公司；SYBRPremixExTaqTM，日本TaKaRa公司；引物设计好后由上海生工生物工程有限公司合成。二、实验方法1、血浆样本收集用EDTA抗凝管分别采集患者和健康对照的静脉血5ml，静置10min后，常温下以3000r/min离心10min，可见分为两层，用移液枪吸取上层透明淡黄色液体即血浆，分装成1ml于1.5mlEP管后，置于-80℃保存。2、血浆总RNA提取(Trizol法)及浓度测定按比例(1ml血浆:3mlTrizol)往血浆加入Trizol，混匀后于4℃放置10min；再按比例(1mlTrizol:200μl氯仿)加入氯仿200μl，剧烈振荡，4℃放置15min，4℃12000×g离心15min后吸取上层水相至新EP管；按比例(1mlTrizol:500μl异丙醇)加入异丙醇500μl，混匀，4℃放置10min，4℃12000×g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；按比例(1mlTrizol:1ml75％乙醇)加入75％乙醇1ml，温和振荡，4℃12000g离心5min，弃上清(重复75％乙醇洗涤一次)，晾干；加10μlDEPC水溶解RNA，吸取2μlRNA溶液用于测定浓度，其余于-80℃保存。将2μlRNA溶液在紫外分光光度计中测定RNA浓度，调节OD260/OD280于1.9-2.1间。3、逆转录反应反应体系如下表：反应条件：37℃，15min逆转录反应；85℃，5s逆转录酶失活反应；4℃，反应结束，产物为cDNA。于-20℃冰箱保存待用。4、引物设计和合成引物设计如下，由上海生工生本文档来自技高网...
【技术保护点】
血浆lncRNA基因标志物在制备早期诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用，其特征在于：所述lncRNA基因标志物由lncRNAMEG3和lncRNAPRNCR1组成。
【技术特征摘要】
1.血浆lncRNA基因标志物在制备早期诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用，其特征在于：所述lncRNA基因标志物由lncRNAMEG3和lncRNAPRNCR1组成。2.一种引物组合物，用于测定血浆中lncRNA基因标志物lncRNAMEG3和lncRNAPRNCR1的表达水平，其特征在于：包括SEQIDNO.1所示的lncRNAMEG3的上游引物、SEQIDNO.2所示的lncRNAMEG3的下游引物、SEQI...
【专利技术属性】
技术研发人员：王莉，张艳峰，孙天娇，
申请(专利权)人：南京盖斯夫医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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