红笛鲷特异性抗体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了红笛鲷特异性抗体及其制备方法，是从一种海水鱼体内提取的高技术生物工程产品及其制备方法，包括三种高纯度，特异性强的血清ＩｇＭ、特异性卵黄抗体和仔鱼抗体。应用商品化的山羊ＩｇＧ免疫性成熟的雌性红笛鲷，取亲鱼的血清、卵黄，催产繁殖，取仔鱼匀浆，以饱和硫酸铵分步盐析与亲和层析纯化特异性抗体。涉及用免疫学方法防治水生动物疾病的技术，对研究提高红笛鲷仔鱼的抗病力和成活率具有极为重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，特别是涉及一种。
技术介绍
大多数鱼的幼体出生或孵化后的一定时间内，其自身的免疫系统尚不完善，不能产生针对特异性病原的抗体，无法抵御水中病原微生物的侵袭，而导致抗病力下降，以致于仔鱼成活率很低。在我国鱼类特别是海水鱼类种苗生产过程中，种苗的成活率很低，如红笛鲷种苗的成活率不到5％，石斑鱼种苗的成活率则更低，这严重制约着我国鱼类规模化育苗的健康发展。传统的手段无法取得很好的效果，如抗生素的长期使用，会导致病原微生物的抗药性增强，使其对动物的抗病促生长效果逐渐降低，增加养殖成本地同时也造成了药物在动物体内的残留和病原菌抗药性的传播。对人体健康也构成严重威胁；而采取免疫手段，仅对成鱼比较合适，而仔鱼此时器官尚未发育完全，对仔鱼起到相反的作用。鱼类种苗死亡率居高不下的直接原因与孵化后仔鱼自身免疫力低有着密切的关系。在这个免疫未熟期内，幼体抵抗病原感染的主要免疫分子是来源于母体的抗体，胎生动物幼体可通过胎盘或初乳获得所需的抗体，而卵生动物则有别于胎生动物。禽类母体的特异性抗体能转移到卵，雏禽出壳后通过卵黄获得母源抗体，其血液中的IgY可为其提供强有力的被动免疫，保护雏禽免受相应疾病的早期感染以提高其自身的抗病能力。由于绝大数鱼类是卵生动物，仔鱼可能象禽类一样能从母体获得特异性抗体。因而，雌亲鱼母源抗体如何转移到仔鱼已成为当今鱼类免疫学家所关注的热点。因此通过免疫亲鱼来提高卵黄抗体的含量使仔鱼获得足够多的母源抗体，保护其免受相应疾病的早期感染以提高其自身的抗病能力，有可能开辟一条新的防治途径。澄清鱼类母源抗体的诸多学术问题的同时也为促进水产种苗生产的健康发展提供重要的理论依据。抗体在所有脊椎动物中都有发现，在机体抵抗病原微生物的侵袭中发挥着重要的作用，鱼类对各类抗原的刺激的特异性反应是通过产生特异性抗体来实现的。用抗体来治疗，预防各种感染及替代减少抗生素的使用已有相当长的历史。由于抗体生产制备过程复杂，来源有限，价格昂贵，使得抗体的应用受到极大限制。鱼类免疫系统以及应答规律的基础研究，都有赖于高纯度的抗体。纯化鱼类抗体常采用凝胶过滤和离子交换层析二者结合的方法，但操作较为烦琐，分离蛋白的纯度达不到要求；SPA亲和层析技术也有应用，而SPA对哺乳类IgG有较高的非特异性结合能力，对鱼类Ig的结合能力差，导致其分离纯化的抗体量少，纯度也不高；用单克隆抗体作配体的免疫亲和层析纯化抗体也有报道，可是单克隆抗体的制备过程较为复杂。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服上述现有技术存在的不足，提供一种。该来源广泛的特异性抗体，涉及其性质详细的说明，并提供一种理想的、适用于实验室小量纯化抗体的有效方法。为对其充分利用提供科学依据，用于防治水生动物早期的低成活率，满足海水鱼类规模化育苗的健康发展。为实现上述目的本专利技术采取的技术方案是本专利技术的红笛鲷特异性抗体的基本特征为1、三种抗体L链分子量均为29kD；2、血清IgM、特异性卵黄抗体H链分子量为80kD；3、仔鱼母源抗体H链分子量为77.5kD；4、血清IgM与人IgM无免疫同源性；5、血清IgM与皮肤粘液、胆汁中的Ig存在相同的抗原决定簇；6、血清IgM的等电点为5.60；7、卵黄抗体的等电点为6.08；8、三种抗体均能够特异性结合山羊IgG和兔抗红笛鲷IgM抗血清。一种红笛鲷特异性抗体的制备方法，包括以下步骤免疫，催产繁殖，取样，饱和硫酸铵分级盐析，亲和层析；应用商品化的山羊IgG免疫性成熟的雌性红笛鲷，取亲鱼的血清、卵黄，对其它亲鱼人工催产，孵化繁殖后，取仔鱼匀浆，以饱和硫酸铵分步盐析与亲和层析2步法，对亲鱼特异性卵黄抗体，仔鱼抗体进行分离纯化，对亲鱼血清抗体直接用亲和层析纯化，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明三种抗体的均一性。所述红笛鲷特异性抗体的制备方法，该方法如下(1)免疫亲鱼①以商品化的山羊IgG按体积比加入等量的弗氏完全佐剂乳化完全后制成抗原a，按体积比加入等量弗氏不完全佐剂乳化完全后制成抗原b；②选择性成熟的雌性红笛鲷作生物反应器，基础免疫和第一次加强免疫用步骤①中抗原a免疫，此后的第二此加强免疫和第三次加强免疫采用抗原b，每次间隔两周，0.3-0.5mL/尾，经腹腔注射免疫；③最后一次免疫完1-2个星期后，用双向免疫扩散检测步骤②中免疫红笛鲷亲鱼所产生的血清抗体效价，取效价1∶8以上的血清，-20℃保存；(2)催产繁殖，取样①最后一次免疫完20-30天后，对步骤(1).②中亲鱼进行人工催产，产卵前取亲鱼卵黄，匀浆、离心后，取上清，-20℃保存；②最后一次免疫完20-30天后，对步骤①中部分亲鱼进行人工催产，孵化繁殖后，取早期仔鱼匀浆，离心取上清，-20℃保存；(3)饱和硫酸铵分级盐析①硫酸铵沉淀步骤(2).①中特异性卵黄抗体的饱和度区间为45～55％，4℃、8000转/分离心20分钟，-20℃保存；②硫酸铵沉淀步骤(2).②仔鱼抗体的饱和度区间为40～50％，4℃、8000转/分离心20分钟，-20℃保存；(4)亲和层析①用亲和层析分离纯化步骤(1).③中亲鱼血清抗体，-20℃保存；亲和层析所用的填料为羊IgG-琼脂糖，平衡液为0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，含0.5mol/L氯化钠，洗脱液为0.1mol/L pH11的甘氨酸-氢氧化钠；②用亲和层析分离纯化步骤(3).①中特异性卵黄抗体，-20℃保存；亲和层析所用的填料为羊IgG-琼脂糖，平衡液为0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，含0.5mol/L氯化钠，洗脱液为0.1mol/L pH11的甘氨酸-氢氧化钠；③用亲和层析分离纯化步骤(3).②中仔鱼抗体，经微孔滤膜过滤后上柱，没有与等体积的磷酸盐缓冲液混匀，而是直接上柱，-20℃保存；亲和层析所用的填料为羊IgG-琼脂糖，平衡液为0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，含0.5mol/L氯化钠，洗脱液为0.1mol/L pH11的甘氨酸-氢氧化钠。本方法以商品化的耦联抗原的琼脂糖作亲和层析介质纯化时可以有效的纯化。该法不仅可得到高纯度的红笛鲷仔鱼母源抗体，而且具有操作简便、耗时少、实验条件要求低的特点。本专利技术的积极效果除了其资源丰富，特异性强，可有效纯化海水鱼的抗体之外，还可以阐明本领域存在的一些极具争议性的问题1.证实了红笛鲷母源抗体的垂直转移，说明红笛鲷血清抗体、卵黄抗体和仔鱼抗体的一致性，卵黄抗体和仔鱼抗体从母体免疫系统转移而来。2.皮肤粘液、胆汁中的免疫球蛋白和血清免疫球蛋白可能是同源的。3.特异性卵黄抗体、仔鱼抗体不是血清抗体的单体，也不是血清抗体的变异精简结构体。本专利技术的三种抗体均能够特异性结合山羊IgG和兔抗红笛鲷IgM抗血清，且纯度和特异性极高，本专利技术的抗体及其衍生物可制备检测红笛鲷体内抗体的试剂盒，已制备多克隆抗体、还可以制备单克隆抗体等，以便更深的研究鱼的一些免疫系统和部分免疫机理等问题。可克服传统研究手段的一些不足。具体实施例方式本专利技术用下列实施例来进一步说明。(1)抗原制备在无菌操作台上将商品化的0.3mg-3mg山羊IgG溶于0.15mL磷酸盐缓冲液后，分别按1∶1与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂乳化后制成抗原a和抗原b，4℃保存备用。(2)亲鱼的免疫基础免疫和14天本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种红笛鲷特异性抗体，其特征是：（１）三种抗体Ｌ链分子量均为２９ｋＤ；（２）血清ＩｇＭ、特异性卵黄抗体Ｈ链分子量为８０ｋＤ；（３）仔鱼母源抗体Ｈ链分子量为７７．５ｋＤ；（４）血清ＩｇＭ与人ＩｇＭ无免疫同源性； （５）血清ＩｇＭ与皮肤粘液、胆汁中的Ｉｇ存在相同的抗原决定簇；（６）血清ＩｇＭ的等电点为５．６０；（７）卵黄抗体的等电点为６．０８；（８）三种抗体均能够特异性结合山羊ＩｇＧ和兔抗红笛鲷ＩｇＭ抗血清。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：简纪常，彭志东，吴灶和，鲁义善，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]